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第四章?????? 目的基因的分离和克隆 第一节??????? 目的基因的获得 第二节??????? 获得目的基因方法的选择 第三节??????? 目的基因重组体的构建 第一节??????? 目的基因的获得 一、化学合成 二、聚合酶链反应（PCR） 方法扩增目的基因 三、建立基因组DNA文库 四、构建cDNA文库筛选目的基因 五、其他方法 一、化学合成法 自动化 DNA合成仪 1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其对 应的多肽链氨基酸序列 2）较短的DNA片段，有专一性和定向性 2.原理：第一个核苷酸固定于不溶性的固相载 体上, 然后按预定顺序从该核苷酸开始，以3’、5’-磷酸二酯键与另一核苷酸进行缩合反应（封闭非反应基团 ），其后用洗涤法除去多余的反应物和副产物, 再用同样的步骤与下一个核苷酸进行缩合反应, 如此循环将合成的寡核苷酸链从载体上洗脱下来, 解除保护基, 进一步纯化。 应用范围：1）合成PCR引物 2）寡核苷酸探针 3）人工接头及较小的基因 二、建立基因组DNA文库 基因组文库：分离真核生物中某种DNA成分, 通常是分离供体细胞中的染色体DNA，酶切后，将这些染色体DNA片段与某种载体相接，而后转入大肠杆菌，建立包含有真核细胞染色体DNA片断的克隆株, 这种克隆株群体。 1.特点：提供全套遗传信息, 即完整的基因组DNA,可以研究基因组中5’端控制基因转录的调控序列, 内含子的分布和作用, 以及重复序列的数量分布及大小 2.构建基因组文库全过程（DNA重组的过程 ） ⑴ 分离纯化基因组DNA, 提取哺乳动物细胞染色体DNA ⑵制备全部基因组的DNA片断 ①机械断裂 法 用超声波或高速搅拌DNA溶液 断裂片段两端没有与克隆载体匹配的粘末端, 因此插入载体之前还需要进行修饰加工，少用 ②限制性内切酶降解（鸟枪法） 过去用EcoRⅠ,现在用Sau3A 断裂片段两端有与克隆载体匹配的粘末端，可以直接与处理过的载体连接。 ⑶ DNA片断与载体的连接包装 常用载体：粘性质粒 λ噬菌体 酵母人工染色体 ①基因组DNA +粘性质粒——重组DNA——转化细菌 菌落 ②基因组DNA + λ噬菌体 ——重组DNA—包装成噬菌体——感染细菌 噬菌斑 1个克隆含有基因组的某个片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和。 基因组文库大小的计算 1975年L.Clarke等提出了一种计算完整的基因组文库最低重组体所需实际克隆数（ N ）的公式： In（1－P） N = ——————— In （1－f） P为在基因组文库目的基因出现的几率（一般为99％）；f为插入的限制片断长度／整个基因组DNA总长度。 例如：从人基因组DNA（总长度为3×109bp）的文库中筛选到长约1.5kb目的基因的可能性为99％，那么这个基因组文库要多大？ In（1－0.99） N = ——————————————— = 9.2×106 In （1－1.5×103／3×109） 若用质粒（pBR322）克隆目的基因（1.5kb）需要有9×106克隆才能汇集人基因组全部DNA序列;若 用λ噬菌体载体可构建含15kb目的基因的人基因组DNA文库，按上式计算所需要的重组体克隆数可以减少到9×105, 而要用柯斯质粒将40kb目的基因片断所需要重组体克隆数可降到3.5×105左右,均可满足建库要求。 四、构建cDNA文库 cDNA文库：以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA ）建立基因文库（gene library）。 特点： cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操作更为方便。 mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特定功能基因工作量较小。 mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利于获得较多的模板。（转录特征） 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白 不同种类不同状态的细胞的cDNA文库不同 不能研究基因组的结构功能 构建cDNA文库 1.制备mRNA 1)取材：mRNA约占总RNA的1－5％，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获胰岛素基因，由应以胰岛β细胞为原始生物材