全基因组扩增方法的建立点及其在法医学中的应用-病理学与病理生理学专业毕业论文.pdf.docxVIP

兰州大学硕士学位论文中文摘要 兰州大学硕士学位论文 中文摘要 研究背景与目的 在法医学检案实践中，常遇到样本DNA含量极其有限，以致DNA分型无 法完成或不能满足重复检测的需要。因此，对微量模板DNA分析便成为法医学 DNA检验的一个难题。以PCR．STR为代表的遗传标记分析技术虽然一定程度上 解决了法医学微量检材的难题，但一些检材仍因DNA含量极其有限而无法检测 成功；或仅检出少数基因座而无法使累计鉴别能力达到认定水平。这类检材被称 为痕量DNA，也称低拷贝模板00w copy number，㈣，Gill等将其定义为低于 lOOpg的模板DNA。为解决这一难题，有研究用增加PCR循环数，但模板DNA 量太低时易产生等位基因丢失或非特异带，且循环数增加到一定程度后再增加循 环数也不会显著增加灵敏度；另外，有人试图用巢式PCR，但巢式PCR技术仅 限于单一位点分析，无法提高目前法医学中常规DNA检测所用的多位点复合扩 增所需的模板数量。全基因组扩增(Whole Genome Amplification，WGA)是一种 能从有限的DNA样品获得充足的DNA量供后续分析的技术，其基本思路是通 过对微量组织甚至单个细胞的整个基因组DNA扩增，大幅度增加DNA的总量。 因此被认为是目前可以解决上述难题的一种有效方法。 WGA技术经10余年探索，在方法上已逐步发展和不断完善起来，已被广 泛用于疾病基因研究等领域，并取得了良好的效果。但在法医学方面的应用很少。 在目前常用的几种WGA方法中，改良扩增前引物延伸方法(Improved pdmer extension preamplification，IPEP)和多重置换扩增方法(Multiple displacement amplification，MDA)对STR基因座分型显示出较好的效果。故本研究探讨了这 两种方法用于法医学微量检材的效果，包括对其灵敏度、扩增忠实性、能否用于 法医学常用STR基因座及常用检材等进行系统性研究，从而对其用于法医学实 践的可行性进行评价，并建立稳定可行的技术方案。 方法 1．对30例口腔拭子样品，采用酚．氯仿法提取DNA，实时荧光定量PCR技 术定量，并分别稀释成lng、0．5ng、O．1ng、O．05ng、O．025ng、O．01ng六种模板 量DNA，然后进行MDA反应和IPEP反应。采用实时荧光定量PCR技术检测 第1页 兰州大学硕士学位论文MDA方法和IPEP方法的产物浓度，比较两种方法的扩增效率。分别以MDA产 兰州大学硕士学位论文 MDA方法和IPEP方法的产物浓度，比较两种方法的扩增效率。分别以MDA产 物和IPEP产物为模板DNA，用AmpFLSTR@Idem访ler《黟试剂盒扩增，ABl3100 基因分型仪检测基因型，比较MDA产物和IPEP产物用于STR分型的效果。 2．对IPEP方法反应体系的成分和终浓度进一步优化，建立改良IPEP方法， 并检测其扩增效率和STR分型效果。将改良IPEP方法用于30例血液、30例血 纱、30例精液等三类法医学常见生物检材进行检测，观察改良IPEP方法的可重 复性和对法医学常见生物检材的适用性。 3．将改良IPEP方法用于20例汗潜指印、20例一次性牙刷、20例自然脱落 头发等三种法医学常见疑难微量检材的模拟案例，观察改良IPEP方法对上述检 材的STR分型效果；用于现场果核10例、矿泉水瓶10例、烟蒂10例、衣领10 例等实际案例，观察改良IPEP方法的实际案件检验能力。 结果 1．MDA法产量为5．15ug一19．75ug，可对模板DNA增加5．15x103—1．9sxlo 倍：IPEP法产量为0．5ng-66ng，可对模板DNA增加25～310倍。MDA法产物 浓度高于IPEP法，差异有显著性意义(F=3643．433，P0．001)。 2．常规检测法、MDA法、IPEP法的基因座检出数有显著性差异 (F=1033．297，P0．001)。当DNA模板量为lng时，常规检测方法、MDA方法、 IPEP方法均可获得复合扩增系统所有基因座的准确分型结果：当DNA模板量为 0．5rig时，常规检测方法和IPEP方法均获得所有基因座的准确分型结果，MDA 方法获得10个以上基因座的准确分型结果：当DNA模板量为0．1ng--,0．01ng时， MDA方法基因座检出数高于常规检测方法，IPEP方法基因座检出数高于MDA 方法。 3．DNA模板量／lng，其MDA产物杂合子基因座的等位基因扩增均衡；DNA 模板量≤0．5ng，其MDA产物的STR分型图谱可见等位基因不平衡或丢失现象， 且模板DNA量越低，等位基因不平衡或丢失现象越明显。DNA模板量／0．05ng， 其IPEP产物杂合子基因座的等位基因扩增均衡；D