PGA基因研究报告.pptVIP

2015学年实验总结 专 业：微生物学 日 期：2016年1月19日 下一步工作计划 1 已完成工作总结 2 出现的问题与解决方法 3 γ-聚谷氨酸合成酶基因pgsBCA在地衣芽孢杆菌中的克隆表达 实验技术路线 抗生素敏感性试验 天然质粒分析 Bacillus licheniformis WBL-3受体菌潜力分析 pgsBCA扩增 表达载体的选择 表达载体构建 原生质体转化 电转化 菌株的构建与表达 发酵条件优化 γ-PGA产量测定 一、已完成的工作 1.WBL-3菌种鉴定与生长曲线测定 2.WBL-3受体菌潜能分析 3.pgsBCA基因扩增 4.原生质体转化法条件摸索 5.构建pgsBCA-pXMJ19穿梭表达载体 1.菌株 WBL-3进行16srDNA菌种鉴定 提取WBL-3基因组 以27F、1492R为引物进行PCR PCR产物纯化后送测 鉴定结果：WBL-3是地衣芽孢杆菌 图2 16srDNA电泳图 2000bp 1500bp 1.地衣芽孢杆菌生长曲线测定 图1 B. licheniformis WBL-3生长曲线 2.受体菌潜能分析 氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素敏感性试验，摇瓶验证 LB培养基 Amp+LB培养基 Kna+LB培养基 Cmr+LB培养基 图3 抗生素敏感性实验图 2.受体菌潜能分析 氨苄青霉素，卡那霉素，氯霉素敏感性试验，平板涂布验证 天然质粒提取验证（不含天然质粒） LB培养基 Amp+LB培养基 Kna+LB培养基 Cmr+LB培养基 图4 抗生素敏感性实验图 2.受体菌潜能分析 结果：（1）对卡那霉素与氯霉素敏感，可选择这两种抗性 的质粒进行后续试验 （2）不含天然质粒，不影响外源质粒的导入 WBL-3具有作为受体菌的潜能进行后续试验 3.pgsBCA基因扩增 CTAB法提取Bacillus licheniformis WBL-3基因组 设计以下引物，通过PCR扩增出足够数量的目的基因 上游：GCGGATCCATGTGGGTAATGCTACTAGCCTGTGTG（BamHI） 下游：GCGGAATTCTCATTTGTTTCACCACTCCGAGTTTGTCCG（EcoRI） 琼脂糖凝胶电泳验证 3. pgsBCA基因扩增 pgsBCA长约2821bp，存在非特异性条带，切胶回收后送测 与GenBank公布的合成酶基因相似性达到99％ 4000bp 2200bp 图5 pgsBCA电泳图 4.原生质体转化法条件摸索 （1）原生质体的制备（显微镜观察原生质体形成过程） 酶解0min 酶解10min 4.原生质体转化法条件摸索 （1）原生质体的制备（显微镜观察原生质体形成过程） 酶解20min 酶解30min 4.原生质体转化法条件摸索 （1）原生质体的制备（显微镜观察原生质体形成过程） 酶解40min 酶解50min 4.原生质体转化法条件摸索 结果：在酶解30min时，原生质体形成率较高；但在40min开始，出现了原生质体结团现象且随酶解时间的延长结团现象越明显。 推测：酶解效果不好或酶解时间过长导致细胞死亡 5.构建pgsBCA-pXMJ19穿梭表达载体 pgsBCA与质粒pXMJ19双酶切后连接，构建表达载体，转化DH5α （1）pgsBCA与质粒pXMJ19经EcoRI和BamHI，37℃双酶切6h （2）双酶切产物纯化 （3）T4连接酶22℃连接6h （4）制备DH5α感受态细胞 （5）加入连接体系复苏 （6）抗性平板涂布，挑取单菌落 （7）菌落PCR，挑选阳性克隆 (1)pgsBCA与质粒pXMJ19双酶切后连接，转化DH5α 抗性平板单菌落 问题：质粒pXMJ19双酶切后只进 行产物纯化，而没有切胶回 收已切开片段，导致平板出 现较多空质粒的假阳性 改进：质粒双酶切后进行切胶回收 后再进行连接转化 5.构建pgsBCA-pXMJ19穿梭表达载体 (2)设计质粒引物，进行菌液PCR 菌落PCR电泳图 2500bp 1000bp 250bp