大规模细分胞培养及发酵技术.pptVIP

铵 细胞培养和发酵中铵的来源: 主要来源: 代谢谷氨酰胺(谷氨酰胺降解) 谷氨酰胺降解成铵和吡咯烷酮酸 其他氨基酸的脱氨基作用 铵的水平也取决于细胞密度和细胞代谢方式. 引起细胞抑制的铵离子浓度范围: 从: 0.5 mM (L Mouse Cells) 到: 40.0 mM (M. Ascites Tumor Cells)(不同的细胞株对铵有不同的耐受度) 铵 pH 会受 NH3增加的影响: NH4+ NH3 + H +  铵的增加也会改变细胞内蛋白质的运动.监控发酵罐和生物反应器中铵的水平（废物）. 推算谷胺酰胺的降解水平. 考察铵浓度对细胞密度和产物浓度的影响. 监控引入培养基的质量. 限制铵抑制的策略 增加换液的速率 (补料). 维持培养液中低的谷氨酰铵浓度减少其转化和降解. 在低的 pH培养减少NH3形成. 去除培养液中的铵: 酶转化 通过特殊的 “PTFE” 膜将 NH3 扩散到低pH 溶液中 使用能够逐步接受高 NH3 浓度的细胞 谷氨酰胺 与葡萄糖一样, 谷氨酰胺也是细胞的主要物质: * 碳和氮 * 能量 谷氨酰胺通常被认为是细胞培养的主要限制营养 谷氨酰胺是生物合成的前体物质:  * 嘌呤 * 嘌呤核苷 谷氨酰胺是合成嘧啶，氨基糖和天冬的主要氨基受体 谷氨酰胺 监控谷氨酰胺的水平: 确保细胞生长所需的能量. 开发长时间细胞培养标准化补料策略. 计算谷氨酰胺的消耗速率和决定批次培养最佳的其始浓度. 谷氨酸 需用来计算谷氨酰胺 需确证谷氨酸 的浓度，确保没加进谷氨酰胺结果. 谷氨酰胺的降解产物 Na/K Na-K: 对合适培养基生产很重要. 维持溶液/培养基合适的离子强度. 渗透压 渗透压是溶液浓度的一个反应: 测定渗透压的参考方法是使用渗透压计 典型细胞培养液渗透压值: 300 +/-30 mOsmol/kg. 渗透压升高 50-100 mOsmol/kg 会明显影响某些细胞的生长. 某些溶液/化合物可作为渗透压的保护剂 (维持渗透压稳定和更低). 这些物质: 甘氨酸，肌氨酸，脯氨酸 渗透压 用于对引进的培养基进行质量控制 关联渗透压与细胞数、细胞活性和产量的关系 监控连续补加营养引起渗透压的增加 细胞密度 细胞密度通常等于 “生物量” 它是指给定体积的细胞数，可以是体积浓度或百分比浓度. 它不是指活细胞数量 (但可很好显示细胞活力） 细胞活力/活性测定取决于细胞的种类、细胞生命周期及膜的结构. “活性取决于你怎样定义细胞.” 细胞密度 细胞密度不意味着终产物量或生产率 它显示 ‘细胞体积/数量’, 但不能体现: 是否细胞是正确细胞. 是否终产物是由细胞产生. 是否所有的细胞是活的. 在细胞中的终产物的量. 大规模细胞培养和微生物发酵技术 细胞培养的概述 动物细胞的特点： 无细胞壁 倍增时间长，生长缓慢 需氧量少，对搅拌敏感 聚集体形成 原代细胞培养50代即开始退化 动物细胞培养的概述 动物细胞培养的定义：动物细胞与组织培养是从动物体内取出细胞或组织，模拟体内的生理环境，在无菌、适温和丰富的营养条件下，使离体细胞或者组织生存、生长并维持结构和功能的一门技术 动物细胞培养的概述 生长特性 贴壁生长型：如人胚肺细胞，Hela细胞，巨噬细胞，神经细胞 悬浮生长型：如血液白细胞、淋巴细胞等 体外培养细胞的基本技术 体外培养特点 体外培养工具 体外培养条件 体外细胞生长增殖过程 培养方法 大规模培养技术 体外培养的特点 营养条件苛刻 适应性差，敏感 培养时间长，易污染 体外培养的条件 温度，37℃ pH：7.2-7.4 气体：氧，二氧化碳，氮气 营养条件：需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可由血清提供 细胞大规模培养技术 细胞大规模培养的方法 反应器贴壁培养 容易换液，不需特殊的分离细胞和培养液的设备，可采用灌流培养获得高密度，但扩大规模较难，适合制备量小，价值高的生物药品。（CelliGen PlusTM） 微载体培养 最有前途的动物细胞大规模培养技术，兼有悬浮培养和贴壁培养的优点，易于放大。（Cytodex，Cytopore和Cytoline） 无血清悬浮培养 用已知人源或动物来源的蛋白或激素代替动物血清的一种细胞培养技术 动物细胞大规模培养过程中重要参数 pH 溶氧 温度 谷氨酸/谷氨酰胺 葡萄糖 乳酸 CO2 动物细胞大规模培养过程中重要参数 NH4+ K+/Na+ Ca++ 渗透压 细胞密度 动物细胞大规模培养存在的问题 细胞凋亡 细胞在高密度条件下，由于细胞的多层生长，存在细胞接触抑制效应，细胞的生长和表达均受到严重影响 动物细胞大规模培养存在的问题 细胞凋亡主要是细胞生长的条件