基因枪和农杆菌介导mir396基因对小麦品种的遗传转化-作物遗传育种专业论文.docxVIP

华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文1．2小麦幼胚组织培养方法 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 1．2小麦幼胚组织培养方法 ．21 1．2．1接种 ．21 1．2．2转化 ．2l 1．2．3分化筛选 ．21 1．2．4再生 ．22 1．2．5春化和移栽 ．22 1．3基因枪转化方法 22 1．3．1质粒向大肠杆菌的转化 ．．22 1．3．2质粒的制备 ．23 1．3．3质粒酶切检测 ．24 1．3．4微弹的制备 ．24 1．3．5愈伤组织的基因枪转化 一25 1．4转基因To代植株PCR检测 ．．26 1．4．1再生苗总DNA的提取 26 1．4．2引物设计 ．27 1．4．3 PCR检测 ．．27 2结果与分析 28 2．1质粒转化大肠杆菌的结果 ．28 2．2基因枪法介导小麦转miR396基因植株的获得 29 2．2．1基因枪介导幼胚转化过程 ．．29 2．2．2抗性植株的PCR检测结果 ．30 3讨{仑 ．．32 第三章农杆菌介导miR396基因的遗传转化 34 1材料与方法 34 1．1材料 ．34 1．1．1培养基 ．34 1．1．2幼胚接种 ．35 1．1．3侵染和共培养 ．35 1．1．4恢复培养 ．36 II 万方数据 基因枪和农杆菌介导MiR396基因对小麦品种的遗传转化1．1．5分化筛选培养 基因枪和农杆菌介导MiR396基因对小麦品种的遗传转化 1．1．5分化筛选培养 ．．36 1．1．6植株再生 ．．36 1．1．7春化和移栽 ．．37 1．2转基因植株的To代PCR检测 37 2结果与分析 37 2．1农杆菌介导小麦幼胚转miR396基因的获得 38 3讨{仑 40 第四章后续试验计划 。．42 参考文献 43 附录 55 致谢 57 III 万方数据 基因枪和农杆菌介导MiR396基因对小麦品种的遗传转化摘要 基因枪和农杆菌介导MiR396基因对小麦品种的遗传转化 摘要 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，与水稻等其它作物相比，其分子生物学 研究相对困难与滞后。然近几年在产量提高，品质改善，抗逆性增强等方面的研究 都取得一定进展。microRNA是真核生物体内普遍存在的一类非编码小分子RNA， 它们通过碱基互补配对的方式介导靶mRNA的降解或是阻遏靶mRNA的翻译来参 与基因的调控，从而影响植物的生长和发育。MiRNA也以不同的方式参与植物生物 和非生物胁迫的逆境响应。前人研究表明miR396不仅影响植物的叶长、分蘖数、节 间长、花粉量等农艺性状，还与植物抗旱、耐盐密切相关。也有研究表明miR396 与植物的春化作用有关，对于一些需经过低温春化才能开花的植物在miR396基因的 作用下不经过此过程就能开花。为创制优异的小麦育种新材料，提高小麦品种遗传 改良之效率，获得不需经过低温春化就能开花的小麦植株。本研究利用基因枪和农 杆菌介导的遗传转化法将来源于水稻的miR396基因转入不同小麦品种中，以期获得 农艺性状或抗逆性优良的转基因株系，使miR396这一优良基因资源得到有效利用。 主要研究结果如下： (1)基因枪法介导miR396转基因小麦植株的获得与鉴定 以华麦2566、华麦2152、陇春23、科农199和郑麦9023为受体材料，用基因 枪法将miR396基因转化到以上小麦品种中。最终获得39株小麦再生植株，其中包 含6株华麦2566，18株科农199，15株陇春23。经过PCR初步检测，共获得7株 阳性植株，其中有5株来源于科农199，2株来源于陇春23。其他小麦品种的转化 材料中均未检测到阳性株系。 (2)农杆菌介导miR396转基因小麦植株的获得与鉴定 以华麦2566、科农199、陇春23、硬粒小麦品种LDN为受体材料，用农杆菌 介导法将miR396基因转入以上小麦品种中，一共获得11株再生植株，但仅得到2 株来源于硬粒品种LDN的阳性株系，这可能是阳性植株的花粉育性受到影响所致， 现未获得转基因后代种子。同时观察发现阳性植株分蘖数显著减少，其育性及分蘖 表型是否与miR396的导入有关还有待进一步研究。 关键词：普通小麦；硬粒小麦；miR396基因；基因枪；农杆菌 万方数据 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文Abstract 华中农业大学2016届硕士研究生学位(毕业)论文 Abstract Wheat(Triticum aestivum L．)is one of the important cereal crop in global，and no one deny the importance of this crop．Although the genotype of this crop little bite difficulty to stu