胸膜肺炎放线杆菌apxⅰa基因的克隆、表达及免疫库原性研究.ppt

胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究 研 究 生： 富 亮　　　　　　　　　　　　　　　　　 指导教师： 赵玉军 教授 徐福洲 博士 专业名称： 预防兽医学 研究方向： 动物传染病学 所在学院： 畜牧兽医学院 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆、表达及免疫原性研究 猪传染性胸膜肺炎概况 猪传染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumonia）是由胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae，APP）引起的猪的呼吸道疾病，其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连，中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润，血管栓塞，纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感，新疫区常急性爆发，急性感染尤其是24～25日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率，发病仔猪迅速死亡，死亡率达到20％以上，最急性型可达80％～100 ％ ，并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源，给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染，给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。 胸膜肺炎放线杆菌概述 胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneumoniae APP），属于巴氏杆菌科（Pasteurellaceae）放线杆菌属（Actinobacillus）。APP是一种革兰氏阴性小球杆菌，有荚膜，有菌毛，不形成芽胞，无运动性，最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型，即生物Ⅰ型和生物Ⅱ型，生物Ⅰ型为辅酶Ⅰ（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide Adenine Dinucleotide，NAD）依赖型，生物Ⅱ型为非NAD依赖型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的，现已发现15种血清型，1型-12型、15型属于生物Ⅰ型，13、14型属于生物Ⅱ型。 APP主要毒力因子 溶血素（Apx毒素） 脂多糖（LPS） 荚膜多糖(CPS) 外膜蛋白(OMP) 尿素酶(Urease) 转铁结合蛋白（Tbp） 粘附素 溶血外毒素 （Apx毒素） APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中，目前已发现产生四种不同的溶血毒素（Repeats in the structural toxin，RTX），称为Apx（Actinobacillus pleuropneumoniae- RTX-toxin，Apx），即ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ。 ApxⅠ的毒性最强，表观分子量为105-110kDa，具有很强的溶血活性和细胞毒性作用，分泌ApxⅠ的血清型有1、5、9、10和11。毒素Ⅰ型的操纵子包括：毒素激活基因apxⅠC，毒素结构蛋白基因apxⅠA，两个分泌基因apxⅠB和apxⅠD，其中apxⅠC负责编码毒素激活蛋白，apxⅠA编码毒素结构蛋白，apxⅠB和apxⅠD与毒素的分泌有关。 apxⅠA基因的N端疏水区是ApxⅠ的免疫原区， apxⅠA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。 ApxⅡ毒素的表观分子量为103kDa～105 kDa，除血清型10以外，其他血清型都可以分泌此毒素。ApxⅡ具有弱的溶血活性，它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用。 ApxⅢ毒素的表观分子量为120 kDa，是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的，ApxⅢ没有溶血活性，但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。 ApxⅣ毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌ApxⅣ毒素蛋白，但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxⅣA与表达载体上的开放阅读框1（ORF1）在大肠杆菌中表达时，它有微弱的溶血活性和协同溶血作用（cAMP）。 不同Apx毒素的生物学特性 Apx操纵子基本结构 胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆与原核表达 技术路线： 引物设计 参照GenBank中apxⅠA核酸序列（D16582），应用Primer5.0软件设计1对引物，其上下游引物中分别含有EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点，预期扩增长度为3158bp，由北京三博远志生物技术有限公司合成。 上游引物： AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT