染色G显带技术及其原理.pptVIP

染色体G显带技术 及其原理 实验原理 (1) 人们将用各种不同的方法，以及用不同的染料处理染色体标本后，使每条染色体上出现明暗相间，或深浅不同带纹的技术称为显带技术（banding technique）。本世纪70年代以来，显带技术得到了很大发展，且在众多的显带技术中（Q带、G带、C带、R带、T带），G带是目前被广泛应用的一种带型。因为它主要是被Giemsa染料染色后而显带，故称之为G显带技术，其所显示的带纹分布在整个染色体上。 实验原理(2) 研究发现，人染色体标本经胰蛋白酶、Na0H、柠檬酸盐或尿素等试剂处理后，再用Giemsa染色，可使每条染色体上显示出深浅交替的横纹，这就是染色体的G带。每条染色体都有其较为恒定的带纹特征，所以G显带后，可以较为准确的识别每条染色体，并可发现染色体上较细微的结构畸变。 实验原理 (3) 关于G显带的机理目前有多种说法，例如，Lee等（1973）认为染色体上与DNA结合疏松的组蛋白易被胰蛋白酶分解掉，染色后这些区段成为浅带，而那些组蛋白和DNA结合牢固的区段可被染成深带。 实验原理 (4) 有人认为，染色体显带现象是染色体本身存在着带的结构。比如用相差显微镜观察未染色的染色体时，就能直接观察到带的存在。用特殊方法处理后，再用染料染色，则带更加清楚，随显带方法不同，显出来的带特点也不一样，说明带的出现又与染料特异结合有关。 实验原理 (5) 一般认为，易着色的阳性带为含有AT多的染色体节段，相反，含GC多的染色体段则不易着色。显带方法的分子学基础涉及核苷酸碱基组成、相关蛋白和基因组功能结构。一般而言，吉姆萨阳性显带（G深带，R浅带）富含AT，复制较迟，基因较少；吉姆萨阴性显带（G浅带，R深带）富含GC，复制较早，基因较多；总的来说，G显带的机理还未搞清。 实验原理(6) 非显带的标本上虽然可以根据染色体的形态识别1，2，3，16，17和18号，有时还可以识别Y染色体，但却不能有把握地鉴别其他大多数染色体。自1970年Caspersson等首次报道用喹吖因对人体染色体进行染色可在各号染色体上显现出宽窄和位置不同带纹以来，细胞遗传学工作者以不同的染色方法为基础，提出了各种显带方法的名称。 实验原理(7) 如用芥子喹吖因作为染料,染出的荧光带称为Q带,其方法称为Q显带法;用Giemsa作为染料,染出的带称为G带,其方法称为G显带法。同样用Giemsa或其他荧光染料作为染料，但在其中加上不同的预处理而获得的与Q带或G带着色强度正好相反的带称为R带，其方法称为反式显带法（R显带法）；将专一的显示“结构性异染色质”的方法称为C显带法，其带称为C带。其它一些显带技术还可以专门显示染色体的端粒（T显带）和核仁组织区（N带）等。  G显带是最常用的，染色体经胰蛋白酶处理后，使染色体的蛋白质变性，然后用一种能结合DNA的化学染料吉姆萨染色，使染色体呈深浅不同的带型，人类的24种染色体可显示出各自特异的带纹。 实验用品(1) 1、材料： 常规方法制备的人外周血淋巴细胞染色体玻片标本(75℃中烤片3小时，未经染色 ) 实验用品(2) 2、器材： 显微镜、恒温培养箱、烤箱、恒温水浴箱、冰箱、立式染色缸、镊子、香柏油、擦镜剂、擦镜纸 实验用品（3） 3、试剂： 1) 2.5％胰蛋白酶原液 2) 0.85％生理盐水 3) Giemsa储存液 4) 1／15M磷酸缓冲液（1/15NA2HPO4、 1/15KH2PO4） 5) 蒸馏水 2.5％胰蛋白酶原液的配制： 胰蛋白酶粉末（1:250）2.5g，100ml 生理盐水，过滤除菌，分装成1ml小瓶于 -20℃保存，用于消化细胞和染色体G显带标本的制作。 生理盐水的配制 氯化钠（NaCl）8.5g，加三蒸水至1000ml，用溶液瓶分装，高压灭菌9 磅，10分钟，可用于细胞培养。 Giemsa存储液的配制 Giemsa粉末1g加少许甘油混合研碎→共计加入甘油66ml，充分混匀→倒入烧杯中在55~60℃水浴中加热2小时→冷却→加入甲醇66ml，充分混合→在室温中静置2~3周，过滤贮存于棕色瓶中，可长期使用。 1/15mol/L 磷酸缓冲液（Phosphate Buffer Solution，PBS）的配制 甲液：1/15mol/L Na2HPO4溶液 Na2HPO4 ?????????????????? 9.465g 蒸馏水????????? ??????????加至1000ml