发酵工程实验讲义.ppt

配置时，量筒定量； 发酵摇瓶（规格250ml），装液量30ml；3L发酵罐 2L； 发酵促进剂难溶于水且不影响pH，故先称量0.3g于摇瓶中； 甘油及K2HPO4用烧杯称量，酵母膏等用称量纸称量； 发酵罐的发酵培养基另加消泡剂：0.01g/100ml。(调整pH后再加) 实验操作—发酵液指标测定 pH：发酵罐在线测定，或者发酵液用pH计测定。 生物量（DCW）：2ml离心管取2ml发酵液，4℃下10000rpm离心3min，上清用来测定酶活，沉淀用Tris-Hcl复溶重悬，再次离心，后重复一次操作，沉淀烘干至恒重（离心管事先编号，在烘箱80℃烘干过夜，拿出到干燥器中冷却，后用镊子拿取，电子天平上称量，记录重量）； 酶活（MTG）； 甘油含量 TG酶的测定 试剂： 底物溶液：12.11 gTris，3.475 g盐酸羟胺，1.536 g还原型谷胱甘肽，5.06 gCBZ-Gln-Gly，调至pH 6.0后定容至500 ml，过滤。 终止溶液（显色溶液）：各配制3 mol/l盐酸溶液，5 %三氯化铁，12 %三氯乙酸500 ml，三者等体积混匀后过滤。 发酵液酶活的检测 1.待测样品用蒸馏水稀释合适的倍数。 2. 分别取待测样品0.15 ml于试管中，准确加入1.5 ml底物溶液于各试管，振荡混合均匀，37℃水浴10 min。 3. 加入1.5 ml终止溶液。 4. 空白管：顺序加入1.5 ml底物溶液，终止溶液1.5 ml。 5. 去除沉淀，在525 nm处以空白管为对照，测定上清液的吸收值。 6. 根据上述酶活公式计算酶活。 注意：OD值范围控制在0.2-1.2之间，方能使用该公式 TG酶的测定 酶活测定注意事项 反应温度37℃； 反应时间10min（精确计时）； 反应时每支管振荡混匀 制作甘油浓度的标准曲线 1. 用蒸馏水稀释甘油标准液至0.04 g/l待用，在一96孔板中取若干孔，分别加入0,5,10,15,20,25 μl稀释的甘油标准液，然后用蒸馏水补足各孔至25 μl。 2. 再在各孔中加入25 μl 高碘酸钠溶液，迅速震荡混匀。 3. 混匀后，室温静置10 min，期间震荡混匀1-2次。 4. 10 min后，各孔加入L-鼠李糖50 μl，迅速震荡混匀。 5.混匀后各孔加入Nash试剂100 μl，放入自封袋中，53℃水浴15 min。 6. 15 min后，以未加稀释的甘油标准液的孔作为空白对照，在酶标仪上测各孔A412的平均值。 7. 以各孔的A412平均值为纵坐标，对应的甘油浓度为横坐标，在坐标纸上或Microsoft Excel软件中绘制标准曲线。 甘油含量的测定 测定未知样品甘油浓度（标准曲线甘油浓度在0-40 μg/ml之间） 1. 将样品用蒸馏水做适当倍数的稀释。 2. 在各孔中加入25 μl样品 3. 重复标曲制作中的步骤2-6的操作。 4. 根据样品稀释液A412值的平均值，在标准曲线上确定出该样品稀释液的甘油浓度。 5. 根据下式计算样品的甘油浓度。 样品甘油浓度（μg/ml）=样品稀释液的甘油浓度*样品稀释倍数 实验要求 1.小组长负责本小组的实验安排、协调。 3.注意保存好本小组的玻璃器皿，实验结束后清点交回，打碎丢失要赔偿！ 4.实验用到高压电流、蒸汽、仪器高的压力、水压不稳定，注意安全！ * * * 发酵工程模块—上游实验 贾彩凤 2015.5 实验目的 进一步理解微生物生产过程的工艺原理，熟悉生产过程。 掌握微生物发酵罐的结构和操作方法。 学习发酵过程中指标的意义及控制，对微生物生产过程有总体的认识。 实验材料 轮枝链霉菌（Streptoverticillium mobaraense）； 菌种特性：好氧菌；以无性孢子或菌丝片断进行繁殖； 发酵生产微生物谷氨酰胺转胺酶(MTGase) 。 TG酶的应用 发酵实验流程图 发酵罐和培养基的灭菌 菌种活化 三角瓶扩大培养 发酵罐清洗与检查 斜面菌种 发酵培养基的配制 加入到发酵罐中 接种 取样 发酵罐发酵的同时，用完全相同的条件，在摇瓶中做平行对照实验。 发酵液 冷冻离心，取上清，冰箱保存 超滤 酒精沉淀 SDS电泳 粗滤 相关知识介绍 1. 培养基 孢子培养基、种子培养基、发酵培养基 2.种子的制备 孢子的制备，种子的制备，菌龄，接种量 1.调整期 2.对数期 3.稳定期 4.衰亡期 1 3 2 4 茂原链霉菌生长曲线 相关知识介绍 3. 液体深层培养的几个关键点 灭菌 温度控制 通气和搅拌