检本pcr技水术及其应用.ppt

PCR及其相关技术 第一节 聚合酶链式反应 PCR 聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction) 一、PCR的反应过程 1.在体外如何使模板DNA的双链解开，提供单链做为模板呢？ 2.在体外如何使引物与模板结合，以催化新的子链的不断延伸？ 添加剂 加入适量二甲基亚砜或甲酰胺 破坏模板的二级结构，利于解链 加入BSA或DTT 增加或改进DNA聚合酶的稳定性。 1.反应温度 变性温度：94℃～97℃ 退火温度：引物Tm －5℃左右 温度过高：降低扩增效率 温度过低：增加非特异性扩增 延伸温度：72℃ 2.反应时间 第一次变性应给予足够时间（5～7分钟） 每一个步骤所需时间取决于扩增片段的长度，一般为30s～1min时间过长易导致非特异性扩增 三、PCR的反应条件 平台出现的迟早与模板的初始量有关，模板初始量越多，平台出现得越早 平台效应产生的因素： 引物二聚体的产生 反应体系各组分的消耗 引物和已扩增的DNA片段间的竞争等 五、PCR技术的质量控制 1.实验室的规范化设置 试剂贮存和准备区 标本制备区 扩增反应区 产物分析区 2 .PCR技术的质量保证 分析前因素：标本采集、运送、稳定化处理 分析中因素：避免污染，保证质量 分析后因素：报告形式、反馈的信息等 五、PCR技术的质