人胰岛素的制平备生物技术制药.ppt

前端引物： 5’-ggt tcc gga tct ggt tct ggt tct ctg gtc ccc cgc ggt agt cac cac cac cac cac cac cgt ttt gtg aac caa cac ctg tgc ggc-3’ 后端引物： 5’-agt gtc gac tta gtt gca gta gtt ctc cag ctg gta-3’ 2，高分子蛋白质 取本品，每1ml加9.6mol／L盐酸溶液3μL酸化，混匀后作为供试品溶液；取供试品溶液100μL，按照重组人胰岛素项下方法检查，除去保留时间大于人胰岛素主峰的其它峰面积，保留时间小于人胰岛素主峰的所有峰面积之和不得过2.0%。 3，锌： 取本品适量，用0.01mol/L盐酸溶液制成每1ml含锌约0.4～0.8μg的溶液作为供试品溶液，按照重组人胰岛素项下的方法检查，每100单位中含锌量应为10～40μg。 4，苯酚或间甲酚： 取苯酚或间甲酚（纯度≥99.5％），精密称定，用 0.01mol／L盐酸溶液定量稀释制成每1ml中约含苯酚或间甲酚 0.25mg的溶液，作为苯酚或间甲酚对照品溶液；精密量取本品适量，用0.01mol／L盐酸溶液定量稀释成每1ml约含苯酚或间甲酚0.25mg的溶液，作为供试品溶液。按照重组人胰岛素效价测定项下方法检查，检测波长为270nm。取重组人胰岛素对照品适量，用苯酚或间甲酚对照品溶液制成每1ml中含重组人胰岛素1mg的溶液，取20μl注入液相色谱仪，苯酚峰、间甲酚峰与人胰岛素主峰的分离度应符合要求。精密量取苯酚或间甲酚对照品溶液及供试品溶液各20μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算。每1ml含苯酚或间甲酚应为2.00～2.75mg。 生物制品包装规程 1.同一车间有数条包装生产线同时进行包装时，各包装线之间应有隔离设施。外观相似的制品不得在相邻的包装线上包装。每条包装线均应标明正在包装的药品名称、批号。 2.药品的内包装和外包装标签的内容、格式应符合国家药品监督管理部门的有关规定。 3.包装制品应在25℃以下进行。有专门规定者应按各论执行。 4.瓶签要求贴牢，直接印字的制品要求字迹清楚，不易脱落或模糊，瓶签内容不得用粘贴、剪贴的方式进行修改或补充。 5.制品包装全部完成后，在未收到产品合格证前，应在待检区封存。收到合格证后，方可填写入库单，交送成品库。 6.每个最小包装盒内均应附有药品说明书。 7.药品说明书应符合《中华人民共和国药品管理法》及国家药品监督管理部门对药品说明书的规定，并根据国家药品监督管理部门批准的内容编写。 粉针剂示意图 安瓿注射剂示意图 成品 小组成员： 沈迪、曾宇、屠言贝、张钰英、张寒光、温馨、谢丹、王亮杰、郭正兵、周明毅 反转录-聚合酶链反应法 (一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录的mRNA 1, 细胞总RNA的提取 : 取胰岛B细胞，用PBS洗后，加入TRIZOL试将细胞破裂，后用DEPC处理，多次离心后，取RNA白色沉淀，测OD值，电泳。 2 ，从总RNA中分离mRNA： 取上述提取的总RNA若干，加入Buffer OBB ，Oligotex Suspension ，打匀。 70℃水浴（裂解RNA的二级结构）， 20-30℃条件下，静置（让Oligotex与mRNA结合）。 将Oligotex/mRNA复合物的沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心，加Buffer将其他RNA洗脱，最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。 （二）mRNA转录合成cDNA第一链 cDNA 第一链的合成 加入上步获得的mRNA和适当引物于EP管中，加入RNase-free water，混匀后,70℃反应10分钟，反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、 RNA酶抑制剂、反转录酶、 dNTP（加入放射性同位素利于检验）， ?混匀，稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析，同位素活性测定。  （三）PCR法扩增，特异合成目的cDNA链 通过胰岛素的特异引物，用PCR法进行扩增，特异的合成胰岛素的cDNA链 ,获得目的基因（通过凝胶电泳回收测序后方可使用）。 PCR法的操作步骤： 预变性 引物退火 引物延伸 循环25-35次 最后延伸 采用pBR322作为载体，用双酶切法进行基因重组。 一 、 pBR322简介 F. Bolivar和R.L. Rodriguez人工构建载体。 其作为载体的优点为： ①双抗菌素抗性选择标记 插入失活，分两次先后选择： 没有获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet中都死亡。获得载体的寄主细胞? 在Amp或Tet其中之一中死亡。 外