第1节dn克a重组技术的基本工具.pptVIP

转基因抗虫棉 抗虫棉 普通棉 基因工程培育抗虫棉简要过程： 普通棉花(无抗虫特性) 苏云金芽孢杆菌 提取 抗虫基因 与运载体 DNA拼接 棉花细胞(含抗虫基因) 棉花植株(有抗虫特性) 上述培育抗虫棉的关键步骤是什么？ 导入 重组DNA 关键步骤一： 抗虫基因从苏云金芽孢杆菌细胞内提取出来 关键步骤二： 抗虫基因与运载体DNA连接 关键步骤三： 抗虫基因导入受体(棉花)细胞 分子手术刀：核酸限制性内切酶（限制酶） 分子缝合针 ：DNA连接酶 分子运输车：载体 专题1：基因工程 基因工程的概念 基因工程的别名 操作环境 操作对象 操作水平 基本过程 结果 基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，故又叫做DNA重组技术或基因拼接技术。 生物体外 基因 DNA分子水平 剪切→拼接→导入→表达 符合人类需要的基因产物 基因拼接技术或DNA重组技术 基因工程的产物 基因工程产品 抗虫害的玉米 转鱼抗寒基因的番茄 转基因鲑鱼 分子手术刀：核酸限制性内切酶（限制酶） 分子缝合针 ：DNA连接酶 分子运输车：载体 1.1 DNA重组技术的基本工具 识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列，并且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。 1、主要来源： 2、作用： 作用特点： 作用位点： 3、结果： 一、 “分子手术刀” ——限制性核酸内切酶 （限制酶） 两种末端 黏性末端 平末端 原核生物 为什么限制酶主要来源于原核生物？其在原核生物中的作用是什么？ 特点：反向、对称、重复排列 为什么原核生物中的限制酶不剪切自身的DNA分子？ 专一性/特异性 磷酸二酯键 限制酶的识别序列： 　 EcoRⅠ 黏性末端　　　　 黏性末端 切割的位点：G、A之间 断裂的化学键是：磷酸二酯键 SmaⅠ 平末端　　　平末端 产生黏性末端或平末端。 限制酶的作用结果： 限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中心轴线（如图），中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向、对称、重复排列的。 想一想限制酶所识别的序列有什么特点？ 为什么限制酶不剪切细菌本身的DNA？ 通过长期的进化，细菌中含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵。 GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG G AATTC CTTAA G G AATTC CTTAA G G CTTAA AATTC G 双链断开 不同来源的DNA片段结合 1、种类： 2、作用部位： 大肠杆菌: E·coli DNA连接酶——黏性末端 T4 噬菌体:T4 DNA连接酶——黏性末端 和平末端（效率低） 磷酸二酯键 二、 “分子缝合针” —DNA连接酶 可把黏性末端之间的缝隙“缝合”起来， E·coli DNA连接酶　　　　　　　　或T4DNA连接酶 即恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键 　 T4 DNA连接酶还可把平末端之间的缝隙“缝合”起来，但效率较低 T4DNA连接酶 要想使两个不同的DNA分子重组，必须用同一种限制性核酸内切酶切割 DNA连接酶与DNA聚合酶比较 DNA聚合酶 DNA连接酶 相同 不同 作用对象 模板 形成磷酸二酯键 单个脱氧核苷酸 DNA片断 需 要 不需要 G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G G C T T A A A A T T C G （二）连接酶的部位： 磷酸二酯键，不是氢键 G C T T A A A A T T C G 磷酸二酯键 磷酸二酯键 重组DNA 三、基因的载体——“分子运输车” 2、载体必须具备的条件： 1）、能够在宿主细胞中稳定保存并复制 2）、具有多个限制酶切点，以便外源基因连接； 3）、具有某些抗性基因（标记基因），便于重组DNA的鉴定和筛选 4）、对受体细胞无害，大小合适 1、常用的载体有： 质粒，λ噬菌体的衍生物，动植物病毒等 常用的载体：质粒 能复制并带着插入的目的基因一起复制 有切割位点 有标记基因的存在，可用含氨苄青霉素的培养基鉴别