副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究预防兽医学专业论文.docxVIP

。llIII 。llIII I I II II I r 111 II I I III Y1 81 2609 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 是 如需保密，解密时间 2010年6月1日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：／§_午 时间：文∞7年6月 7日 I 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，并授权中国科学技术信息研究所和北京万方数据股份有限公司将本人 学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并进行信息服务(包括但不限于汇编、 复制、发行、信息网络传播等)，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力． 注：保密学位论文(即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文)在解密后适用于本授权书． 学僦文储始斜导师张峥络 签名日期：≥cPo 7年6月1日。 签名日期：庐一7年∥月伊日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究目 副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的鉴定与功能研究 目 录 摘兰要 1 Abstract ．．3 缩略语表(Abbreviation) 5 第1章文献综述 7 1．1副猪嗜血杆菌病 ．7 1．1．1病原学 ．7 1．1．2血清与基因型 。9 1．1．3临床症状 11 1．1．4病理变化 12 1．1．5致病机理及毒力因子 13 1．1．6免疫与疫苗 16 1．2 SCOTS技术概述 ．1 8 1．2．1多种差异显示技术的比较 18 1．2．2 SCOTS技术原理 22 1．2．3 SCOTS技术的应用 23 1．2．4 SCOTS技术的优缺点 26 1．3反向疫苗学研究 ．27 1．4酵母双杂交技术 ．．29 1．4．1酵母双杂交系统的原理 29 1．4．2酵母双杂交系统的应用 3 l 1．4-3酵母双杂交系统的优缺点 32 第2章副猪嗜血杆菌感染和应激相关基因的筛选 ．34 2．1前言 34 2．2材料与方法 ．．35 2．2．1主要试剂和仪器 35 2．2．2培养基，抗生素及铁离子螯合剂的配制 36 2．2．3主要缓冲液 36 2．2．4菌株、质粒及引物 37 2．2．5缺铁、高温及正常体外培养条件 40 2．2．6细菌计数 40 2．2．7实验动物的分组与感染 40 2．2．8菌株的分离和鉴定 40 2．2．9 rDNA基因的克隆 ．41 2．2．10基因组DNA的制备 43 华中农业大学博士学位论文2．2．11基因组DNA和rDNA基因克隆质粒的超声波处理 华中农业大学博士学位论文 2．2．11基因组DNA和rDNA基因克隆质粒的超声波处理 44 2．2．12基因组DNA的光敏生物素酰化 44 2．2．1 3 RNA提取及双链cDNA的合成及扩增 。44 2．2．14 cDNA的SCOTS标准化 ．45 2．2．1 5 cDNA的SCOTS富集 。46 2．2．1 6 SCOTS文库的克隆 ．46 2．2．17反向Southern斑点杂交技术筛选阳性克隆 ．47 2．2．18测序检测生物信息学分析，对筛选到的基因进行功能注释 。47 2．2．19荧光定量RT-PCR 47 2．3结果与分析 。48 2．3．1副猪嗜血杆菌rDNA重组载体的验证 ．48 2．3．2副猪嗜血杆菌肺组织感染相关的基因 ．49 2．3 3副猪嗜血杆菌铁应激相关的基因 ．．58 2．3．4副猪嗜血杆菌高温应激相关的基因 63 2．4讨论 ．67 2．4．1副猪嗜血杆菌肺组织感染相关的基因 ．67 2．4．2副猪嗜血杆菌铁应激相关的基因 70 2．4．3副猪嗜血杆菌高温应激相关的基因 ．73 第3章副猪嗜血杆菌感染和应激相关蛋白的免疫原性的研究 ．．77 3．1前言 ．77 3．2材料和方法 77 3．2．1主要试剂 77 3．2．2主要缓冲液 78 3．2．3预测候选抗原蛋白的信号肽 79 3．2．4菌株和培养条件，血清，质粒和引物 79 3．2．5实验动物 8 l 3．2．6候选抗原基