实验三 多糖含量的测定..pptVIP

实验三 生物药物含量的测定—分光 光度法测定多糖的含量 实验性质：验证性实验 学时数：4学时 生物制药实验课程 实验目的： 掌握分光光度法测定多糖含量的原理和方法； 用坐标纸描绘标准曲线和用Office excel求标准曲线。 实验原理： 随着对生物药物、天然药物和保健食品研究的深入,多糖的研究进展很快.目前多糖含量的测定方法尚无统一标准,广泛应用的是苯酚-硫酸比色法.该法具有简单、快速、无需多糖纯品和贵重仪器等优点,且对水溶性样品和非水溶性样品均可测定. 原理是：多糖或寡糖被浓硫酸在适当高温下水解，产生单糖，并迅速脱水成糠醛衍生物，该衍生物在强酸条件下与苯酚起显色反应。生成橙色物质，在波长490 nm处和一定浓度范围内，其吸光度A值与糖浓度C呈线性关系，从而可用比色法测定其含量。 实验条件 试剂与仪器： 仪器：移液管（1mL，2mL）各2支，玻棒、电子天平，10mL量筒，50mL容量瓶8个，分光光度计（7200型）、洗耳球、烧杯等。 试剂：葡萄糖、5%苯酚、浓硫酸、蒸馏水。 材料：坐标纸、铅笔、橡皮擦。 实验步骤：标准曲线的绘制 精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖l00 mg于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶液。(也可：精密称取1水葡萄糖0.0551 g于50 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，作为对照品溶液)此标准溶液1.0mL含葡萄糖1.0mg。 精密量取该溶液0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL分别置于已编号的 50 mL容量瓶中，加蒸馏水定容，吸取上述溶液各2.0 mL，再加入5％苯酚溶液1.0 mL，摇匀。迅速加入硫酸5 mL，摇匀，室温放置5 min．90 ℃水浴加热15 min。冷却至室温；以蒸馏水作参比．测定在波长490 nm处的吸光度，得浓度(c)与吸光度(A)的线性回归方程。 实验步骤： 目标产物的测定 精密称取干燥至恒重的芦荟粗多糖2mL于50 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度。取1.0 mL，加入5％苯酚溶液2.0 mL，然后按第1.2步操作，测定其吸光度。并由标准曲线方程求出溶液浓度，得出芦荟粗多糖中的总糖含量。 思考题 用苯酚—硫酸比色法测定多糖含量的原理及注意事项？ 分析误差产生的原因？ 实验报告 按规范格式写出实验报告（实验顺序、名称、姓名、学号、实验目的、原理、步骤、实验结果与记录、思考题、注意事项） 本实验还要求： 用坐标纸绘出标准曲线； 计算多糖的浓度； 用Microsoft Excel作图，绘曲线及求方程和r值。 注意事项 实验过程要特别细心，尽可能减小误差。 注意浓硫酸的正确使用。 分光光度计的正确使用。 苯酚有毒。苯酚及其浓溶液对皮肤有强烈的刺激作用，若不慎将苯酚沾到皮肤上，应用酒精或聚乙二醇清洗；若量较大或者混有氯仿，则需要进行急救。沾到衣服上也需用大量水冲洗。