免疫检验第十三章免疫细胞分离与检测.ppt

* 第十三章 免疫细胞分离与免疫细胞 功能检测及应用 【掌握】外周血单个核细胞、淋巴细胞、T细胞亚群分离的原理；T、B细胞、NK细胞主要的表面标志。各种淋巴细胞功能检测的原理. 细胞分离基本原理 不同细胞密度不同 人的红细胞密度为1.093 粒细胞密度为1.092 单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的密度为1.075-1.090 不同细胞表面生物学特性不同 不同细胞表面分化抗原不同 外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞。 Ficoll分离液法主要用于分离外周血中的单个核细胞，是一种单次差速密度梯度离心的分离法。 密度梯度离心(Ficoll)离心　 二 、淋巴细胞分离（去单核细胞） 贴壁粘附法 （单核细胞贴壁生长的特点、将悬液置玻璃或塑料器皿，未贴壁的为淋巴细胞，此法易造成B流失） 吸附柱过滤法 （单核细胞贴壁生长的特点，将细胞悬液注入装有玻璃纤维或葡聚糖凝胶的层析柱中，洗脱下来的为淋巴细胞） Percoll 分离液法 （连续密度梯度离心，不同密度的细胞悬浮于各自不同的密度区带） Percoll法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图 E花环沉降法 （T细胞与绵羊红细胞 形成E花环后用淋巴细胞分层液分离， E花环沉在管底） 尼龙毛柱分离法 （B细胞和单核细胞易粘附于尼龙纤维表面，将用HANKS液浸泡后的单个核细胞悬液加入充填有尼龙毛的聚乙烯塑料管内，洗脱液中为T细胞，然后边冲边挤压塑料管，洗下B细胞。 三、T、B细胞和T细胞亚群的分离 大小免疫磁珠分离细胞的特点比较 比较项目 大磁珠 小磁珠 对细胞的影响 对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。 对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。 对流式细胞仪的影响 阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。 可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。 分离条件要求 技术简单，分离可在试管中完成。 需要很强的磁场来分离细胞。 收率 得率高。 得率不高。 纯度 纯度低。 纯度高。 分离时间 分离速度快。 分离速度慢。 分离成本 成本低。 需要很强的磁场来分离细胞，需要一次性的分离柱，不能在普通试管进行。 第二节 淋巴细胞表面标志的检测及亚群分类 常用于鉴定和检测淋巴细胞表面标志是簇分化抗（CD）。 一、T细胞表面标志及其亚群 CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞 （help T cell,Th） CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞 （cytotoxic T cell,Tc or CTL） CD4+CD25+ Foxp3 +调节性T细胞 （regulatory T cell,Tr or Treg） 辅助性T细胞 Th1（IL-2、IFN-γ、TNF-β CD3+CD4+CD30- ) Th2（IL-4、IL-5、IL-6或IL-10 CD3+CD4+CD30+） 细胞毒性T细胞 Tc1（CD3+CD8+CD30- ) Tc2（CD3+CD8+CD30+） 调节性T细胞 CD4+CD25+调节性T细胞 CD8+调节性T细胞 二、B细胞表面标志 SmIg、Fc受体、补体受体、EB病毒受体、小鼠红细胞受体都是B细胞的重要表面标志，其中以SmIg为B细胞所特有，是鉴定B细胞可靠的指标。 成熟B细胞的mIg主要为mIg M、mIgD。 CD19/CD5分子：可将B细胞区分为B1细胞和B2细胞，B1细胞为CD19和CD5双阳性，而B2细胞仅为CD19阳性，B2细胞为通常所指的B细胞。 人类NK细胞表面标志主要以CD16、CD56来认定，临床上将CD3-CD16+CD56+淋巴细胞认定为NK细胞。 三、NK细胞表面标志 第三节抗原提呈细胞表面标志的检测 抗原提呈类细胞表面标志 第四节 淋巴细胞功能检测 淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。 体内实验主要是进行迟发型超敏反应，间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应. 体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定. 淋巴细胞分类 T细胞（负责细胞免疫功能） B细胞（执行体液免疫功能） NK和K细胞（非特异性免疫作用） 1. 原理： 淋巴细胞 DNA合成 分化 母细胞 刺激物 细胞变大 细胞浆扩大 空泡 核仁明显 核染色质疏松 （一）T淋巴细胞增殖试验 未转化和转化淋巴细胞的形态特征 转化的淋巴细胞 未转化的淋巴细胞 淋巴母细胞 过渡型 细胞大小(直径μm) 12～20 12～16 6～8 核大小、染色质 增大、疏松 增大、疏松 不增大、密集 核仁 清晰、1