流式细胞技术和式细胞仪.pptVIP

第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 一、流式细胞仪的分类 流式细胞仪根据其结构不同又可分为一般流式细胞仪和狭缝扫描流式细胞仪。 前者的光斑直径大于被检细胞体积，只能提供细胞内某种生物化学成分的参数。 狭缝扫描流式细胞仪被检细胞直径大于激光光斑直径，可计算出细胞直径大小、核直径大小、核浆比例等一系列的形态学信息的定量资料。 第二节 流式细胞仪的分类与结构 狭缝扫描流式细胞仪 被检细胞直 径大于激光光斑 直径，细胞通过 光束时各部分被 依次扫描。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 二、流式细胞仪的基本结构 （一）流动室与液流驱动系统 流动室由石英玻璃制成，并在石英玻璃中央开一个孔，供细胞单个流过，检测区在该孔的中心，流动室内充满了鞘液,鞘液的作用是将样品流环包。 样品流在鞘流的环包下形成聚焦，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 由右图可知，空 气泵产生压缩空气， 通过鞘流压力调节器 加在鞘液上一恒定的 压力，这样鞘液以匀 速运动流过流动室， 在整个系统运行中流 速是不变的。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 由于激光焦点处能 量分布为正态分布（见 图），中心处能量最高。 因此，当样本速率选择 高速时，处在样本流不 同位置的细胞或颗粒， 受激光照射的能量不一 样，从而被激发出的荧 光强度也不相同。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （二）激光光源与光束成形系统 激光是一种相干光源，它能提供单波 长、高强度及稳定性高的光照。由于细胞 的快速流动，每个细胞经过光照区的时间 仅为1μs左右，且细胞所携带荧光物质被 激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间 和激发光的强度有关，因此细胞必须达到 足够的光照强度。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （三）光学系统 FCM的光学系统是由若干组透镜、滤光片和 小孔组成。 滤光片主要分为： 1.长通滤光片 长通滤光片使特定波长以 上的光通过。 2.短通滤光片 特定波长以下的光通过。 3.带通滤光片 带通滤光片允许一定波长 范围内的光通过 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 当细胞携带荧光素标记物，通过激光 照射区时，细胞内不同物质产生不同波长 的荧光信号。这些信号以细胞为中心，向 空间360度立体角发射，产生散射光和荧光 信号。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 1.散射光信号 散射光分为前向角散 射和侧向角散射，散射光不依赖任何细胞 样品的制备技术(如染色)，称为细胞的物 理参数（或称固有参数）。 （1）前向角散射 前向角散射与被测细胞 的大小有关 （2）侧向角散射 侧向散射光 可提供细胞内精细结构和颗粒性质的信息。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 当激光光束与细胞正交 时，一般会产生两种荧光信号。一种是细 胞自身在激光照射下发出微弱的荧光信号， 称为细胞自发荧光；另一种是经过特异荧 光素标记细胞后，受激发照射得到的荧光 信号，通过对这类荧光信号的检测和定量 分析能了解所研究细胞的性质和数量。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 （1）荧光信号线性测量和对数测量 线性放大器的输出与输入是线性关系，细 胞DNA含量、RNA含量、总蛋白质含量等的 测量一般选用线性放大测量。在细胞膜表 面抗原等的荧光检测时通常使用对数放大 器。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 （2）荧光信号的面积和宽度 荧光信号的面积是采用对荧光光通量进 行积分测量，一般对DNA倍体测量时采用 面积，这是因为荧光脉冲的面积比荧光 脉冲的高度更能准确反映DNA的含量。 荧光信号的宽度常用来区分双连体细胞。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 （四）信号检测与分析 2.荧光信号 （3）光谱重叠的校正 当细胞携带两种荧光受激光激发而发 射两种不同波长的荧光时，理论上可选择 滤片使每种荧光仅被相应的检测器检测， 但由于目前所使用的各种荧光染料都是宽 发射谱性质，虽然它们之间发射峰值各不 相同，但发射谱范围有一定的重叠。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 从右图中可以看 出，阴影为探测器检 测光谱的范围，FITC 探测器会探测到少量 的PE光谱，而PE探测 器则检测到较多的 FITC光谱。 第二节 流式细胞仪的分类和基本结构 图中点A通过透镜f 成像在A’处，而点B通 过透镜f成像在B’处。 在光电倍增管前放上一 小孔，作为空间滤波器， 排