原创力文档- 1、原创力文档（book118）网站文档一经付费（服务费），不意味着购买了该文档的版权，仅供个人/单位学习、研究之用，不得用于商业用途，未经授权，严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等，侵权必究。。
- 2、本站所有内容均由合作方或网友上传，本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺！文档内容仅供研究参考，付费前请自行鉴别。如您付费，意味着您自己接受本站规则且自行承担风险，本站不退款、不进行额外附加服务；查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档，您可以点击 这里二次下载。
- 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等，请点击“版权申诉”（推荐），也可以打举报电话：400-050-0827(电话支持时间：9:00-18:30)。
- 4、该文档为VIP文档，如果想要下载，成为VIP会员后，下载免费。
- 5、成为VIP后，下载本文档将扣除1次下载权益。下载后，不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们。
- 6、成为VIP后，您将拥有八大权益，权益包括：VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
- 7、VIP文档为合作方或网友上传，每下载1次， 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等，对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
实验十八 （2转基因烟草总DNA和质粒DNA的提取
* * 实验十八 （2）转基因烟草总DNA和质粒DNA的提取 一、原理 CTAB（十六烷基三甲基溴化氨）溶解植物细胞膜，有利于核酸与蛋白质解离，并与DNA形成CTAB-DNA复合物，防止DNA剪切（降解），同时减轻细胞壁多糖对DNA提取的影响。提取液中加入PVP和?巯基乙醇能防止酚类物质的氧化。在低盐条件下， CTAB-DNA复合物离心沉淀，与多糖类、色素、多酚物质和蛋白质分离。 碱裂解法使细菌染色体DNA与质粒DNA分离。 二、实验目的 学习和掌握植物总DNA微量提取的技术，应用质粒DNA提取方法，为鉴定转基因烟草准备材料。 三、实验材料、试剂和仪器 1、材料：在筛选培养基上再生的烟草植株，JM109菌株 2、试剂：CTAB提取液、液氮等 3、仪器：水浴锅、电泳仪、紫外观察仪等 四、实验步骤 1、pBI121质粒的提取 1.5ml过夜菌4000rpm离心5min，弃液 加100?l预冷溶液I，震荡混合，加少量溶菌酶，冰浴5min 加200?l新鲜溶液II，颠倒混匀，冰浴5min 4℃ ，12000 rpm 5min，转移上清液 加入等量酚/氯仿，混匀，如上离心3min 加2倍体积乙醇，-20℃中2-3hr 4℃ ，12000rpm 10min，70%乙醇洗沉淀 加150 ?l预冷溶液III，震荡10秒，冰浴10min 空气干燥，50?l TE溶解，-20℃贮存 2、植物总DNA的微量提取 0.1-0.2g叶于液氮中研磨成粉 加0.5ml 65℃预热的CTAB提取缓冲液 65℃水浴中提取30min，间歇混匀 加0.5ml氯仿-异戊醇（24:1）混匀抽提 12000 rpm离心10min 上清液中加2/3体积预冷异丙醇 -20 ℃ 30min 4℃8 000 rpm离心5min 76％乙醇漂洗20min 溶于400?l TE，加1?l RNase A, 37℃30min 等体积酚-氯仿 抽提，离心同上 上清液加等体积的氯仿-异戊醇，离心 上清液加3M NaAc至0.3M，混匀 加2倍体积无水乙醇，-20 ℃下30min以上 10 000rpm离心10min，弃上清液 80％乙醇洗沉淀2次，吹干 ，溶于适量TE，备用 3、电泳检测 （1）0.7%琼脂糖凝胶（5 ?l Goldenview/100ml） （2）取5?lDNA溶液+1 ? l载样缓冲液 （3）电泳：电压40-50V，电泳1-2hr。 （4）紫外灯下观察结果并照像记录。 *
文档评论（0）