Agilent 1260 HPLC 工作原理及色谱柱的使用和保养20140222.ppt

色谱柱的领用及归还 分析室所有色谱柱按照类型进行编号登记造册，建立色谱柱档案，注明采购时间及使用项目名称。 领用新的色谱柱时由使用人按照说明书进行冲洗，按要求测柱效，并做好记录。 分析室所有色谱柱统一放置，取出及归还色谱柱时要做好登记。 试验结束后，使用人要正确冲洗色谱柱，同时记录好与试验、色谱柱相关的信息；不影响自己及其他人的再次使用 如发现色谱柱压力高、峰型差等异常问题，使用人要及时冲洗并按照说明书检测柱效，遇柱效差或分离差的色谱柱附上柱效检测报告，报室主任，同意后报废，统一放置。 色谱柱的使用和保养 色谱柱的使用及操作 流动相的转换 特别是GPC柱 流速(压力)的变化幅度 温度的变化幅度 专用色谱柱∶样品及溶剂的要求 色谱柱的使用和保养 色谱柱的保养（一） 样品方面 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度 如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用 色谱柱的使用和保养 为什么溶剂和样品要过滤? 溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 样品过滤头的类型： 30mm 内径：适用于大进样量的过滤，由0.22μm 和0.45μm 两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。 13mm 内径：适用于范围广的过滤，由0.22μm 和0.45μm 两种规格,材料为纤维素。 3mm 内径：适用于小进样量的过滤，由0.22μm 和0.45μm 两种规格。处理样品体积为7μl。 色谱柱的使用和保养 色谱柱的保养（二） 流动相方面 除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例 色谱柱的使用和保养 溶剂过滤-除去微粒 不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。 遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命： 使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。 用滤膜过滤溶剂去除微生物。 每天更换或过滤溶剂。 避免溶剂瓶直接日照。 向溶剂中加入0.0001-0.001M的叠氮化钠。 ? 色谱柱的使用和保养 溶剂准备：过滤 色谱柱的使用和保养 选择合适的滤膜 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺 再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。 注意：1）每张滤膜只能用一次。 2）水相和有机相不要搞混。 色谱柱的使用和保养 溶剂的相溶性 色谱柱的使用和保养 溶剂信息 避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂： 卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。 高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。 能够形成卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。 含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。 在有机溶剂中的有机酸溶液。 含有强络合剂的溶液。 四氯化碳和异丙醇或THF混合液。 色谱柱的使用和保养 溶剂截止波长 色谱柱的使用和保养 溶剂准备：脱气 色谱柱的使用和保养 流动相使用前为什么要脱气？ 流动相使用前必须进行脱气处理 ，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。 色谱柱的使用和保养 典型的流速 色谱柱的使用和保养 色谱柱保护 色谱柱的使用和保养 色谱柱常见毛病 柱压过高 多少才算高? 不同色谱柱有差异 不同系统有差异 不同溶剂有差异 柱效低 重复性差 不出峰，回收率低 色谱柱的使用和保养 柱压过高 为什么柱压会过高 微粒堵塞 样品 流动相 密封垫 柱床膨胀 不可逆吸附 细菌生长 色谱柱的使用和保养 柱效低 为什么柱效低 色谱柱被污染 过滤片部分堵塞 样品、流动相或密封垫的细小颗粒造成的堵塞 色谱柱内的死体积 流动相pH值及组成不合适造成固定相流失 流速急剧变化造成固定相物理损坏 机械震动造成固定相产生裂缝 柱床收缩或干枯