应用实时荧光PCR技术检测构巢曲霉的初步研究.PDF

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００８，２８（１０）：９５～９９ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 殏檪檪 研究简报殏檪 檪檪檪檪檪檪檪檪 应用实时荧光ＰＣＲ技术检测构巢曲霉的初步研究 １，２ ２ ３ ２ ２ 刘金华 　贺　丹 　史艳宇 　张　宇 　王　丽 （１吉林出入境检验检疫局　长春　１３００６２　２吉林大学基础医学院病原生物学教研室　长春　１３００２１） （３吉林省产品质量监督检验研究院　长春　１３００２２） 摘要　目的：根据构巢曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）３磷酸甘油醛脱氢酶（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ３ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ，ＧＡＰＤＨ）基因特异位点设计并合成Ｔａｑｍａｎ探针及引物，建立构巢曲霉实时荧光 ＰＣＲ检测方法。方法：应用ｌａｓｅｒｇｅｎｅ７．１软件对构巢曲霉与 １３种常见曲霉主要包括黑曲霉（Ａ． ｎｉｇｅｒ）、烟曲霉（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、杂色曲霉（Ａ．ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、土曲霉（Ａ．ｔｅｒｒｕｓ）、黄曲霉（Ａ．ｆｌａｖｕｓ）、温特 曲霉（Ａ．ｗｅｎｔｉｉ）、寄生曲霉（Ａ．ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、泡盛曲霉（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、米曲霉（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、棒曲霉 （Ａ．ｃａｖａｔｕｓ）、赤曲霉（Ａ．ｒｕｂｅｒ）、亮白曲霉（Ａ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）及赭曲霉（Ａ．ｏｃｈｒａｃｅｕｓ）进行ＧＡＰＤＨ基因 序列比对分析，在特异位点设计引物和探针，建立构巢曲霉实时荧光 ＰＣＲ检测方法，并对该方法 进行特异性及敏感性分析。结果：用曲霉属２２种４１株不同曲霉及其他属的１２株病原真菌验证 －１２ 实验表明，所建立的荧光ＰＣＲ方法特异性强；检测灵敏度可达４．０３×１０ ｇ／ｍｌ的模板ＤＮＡ。结 μ 论：应用实时荧光ＰＣＲ技术能够有效检测构巢曲霉，该方法具有特异、灵敏、快速等特点，可在实 际工作中应用。 关键词　构巢曲霉　实时荧光ＰＣＲ　检测 中图分类号　Ｑ９３ ［６］ 　　构巢曲霉（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｄｕｌａｎｓ）是遗传学和生物化 因为目的基因 ，根据其特异位点设计引物及探针，建 ［１，２］ 立了实时荧光ＰＣＲ方法来检测构巢曲霉，并对方法的 学研究得最广泛的生物之一 ，常被用来做基因功能 ［３，４］ 特异性及灵敏性进行了验证。 鉴定和蛋白质相互作用研究的模式生物 。构巢曲 霉经常污染粮食和食品，而且有８０％以上的菌株产毒。 １　材料与方法 构巢曲霉在一定环境下产生的杂色曲霉毒素ＩＶａ，是毒 ［５］ １．１　供试菌株及培养条件 性最强的真菌毒素之一 ，其致癌性仅次于黄曲霉毒 素。因此，构巢曲霉是工业、农业生产中经常检验的霉 　　供试菌株分别购自中国普通微生物菌种保藏管理 菌之一。 中心 （ＣＧＭＣＣ）及中国工业微生物菌种保藏中心 　　构巢曲霉传统的检验鉴定常采用培养法，根据结 （ＣＩＣＣ），其中黑曲霉 ＡＴＣＣ１６８８８、ＡＴＣＣ１６４０４购自上 构形态学特征来进行判定，该方法检测周期长，受个人 海汉尼公司。其他菌株来自吉林大学白求恩医学院病 经验等主观因素影响多，不能快速有效地对构巢曲霉 原生物学教研室菌种保藏中心（ＪＬＣＣ）及本实验室从送 进行鉴定。本实验以构巢曲霉的３磷酸甘油醛脱氢酶