实时荧光定量PCR(qPCR)技术简介.pdf

微基生物—— 您自己的微生态研究团队 实时荧光定量PCR 技术简介 实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一项以PCR 反应为基础的DNA 定量技术，通过对目标基因在扩增过程中产生的拷贝数进行实时的定量，从而达到对目的基 因的定性和定量分析。现有两种常用的方法对PCR 产物进行荧光定量：一种是利用荧光染 料与双链DNA 结合，通过荧光强度进行定量；另一种是利用携带了荧光报告基团的特异 DNA 探针对目标基因进行定量。 一、利用荧光染料进行定量 一种最为常用的定量方法就是在PCR 反应体系中加入荧光染料，此类荧光染料会与所 有的双链DNA 结合，并产生荧光。游离的荧光分子不会产生荧光信号，只有与双链DNA 结合的荧光分子才会释放荧光，随着DNA 拷贝数的增加，测得的荧光强度也会增强。 利用荧光染料进行定量的优势就是成本低廉，只需要一对普通的引物就能完成定量。然 而，常用的诸如SYBR Green 染料会与所有的双链DNA 无差别地结合，包括引物二聚体， 因此有可能会导致对目标基因的定量不精确，灵敏度偏低。 二、利用荧光探针进行定量 荧光探针只能检测出与自身序列互补的DNA 片段，因此用探针法定量可以有效地避免 引物二聚体的干扰，使定量结果更加精确。此外，通过使用携带不同荧光信号的多种探针， 我们可以同时对一个样品中的多个靶序列进行定量。 荧光探针的5 ’端携带有一个荧光报告基团，3 ’端则为淬灭基团，在正常情况下两个 基团间的距离很近，淬灭基团会抑制报告基团使其无法发出荧光。在PCR 反应过程中，引 物和荧光探针在退火阶段都会与目的片段结合；在延伸阶段，Taq 酶因为具有5 ’-3 ’核酸 外切酶活性，会将探针，使得报告基团和淬灭基团相互分开，从而释放出荧光。每增加一条 目的基因的拷贝，就会有一个探针被切开并释放荧光信号，因此随着PCR 反应的进行，荧 光信号会逐渐增强。 微基生物科技（上海）有限公司 1 / 2 微基生物—— 您自己的微生态研究团队 使用探针进行荧光定量的优点就是精确度和灵敏度都要比荧光染料高，且可以做到同时 对多个基因进行定量，但是相应的合成探针的成本也要比使用荧光染料高出许多。 微基生物科技（上海）有限公司，是一家专门从事微生态/微生物分子生态学相关问题 研究的高科技服务公司。公司拥有经验丰富的技术团队，能为客户提供全面的实时荧光定量 PCR 技术服务。若想了解更多相关信息，请至公司官网或致电客服进行咨询。 微基生物科技（上海）有限公司 2 / 2