染色质免疫沉淀技术实验指导.pdf

染色质免疫沉淀(ChIP) 染色质免疫沉淀技术是目前唯一研究体内DNA 与蛋白质相互作用的方法。 它的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白质 DNA 复合物，并将其随机切断为一 定长度范围内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富 集目的蛋白结合的DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质 与DNA 相互作用的信息。 近年来，这种技术得到不断的发展和完善，帮助研究者判断在细胞核中基因 组的某一特定位置会出现何种组蛋白修饰，也可结合微阵列技术在染色体基因表 达调控区域检查染色体活性，是深入分析癌症、心血管疾病以及中央神经系统紊 乱等疾病的主要代谢通路的一种非常有效的工具。 实验前准备 在实验开始前，先准备好本次实验所需的各种试剂盒和相关常规试剂，如本 次实验分装Pierce Agarose ChIP Kit ，此试剂盒，提供了简化的方法来实现交联反 交联、蛋白消化、免疫沉淀和DNA 纯化。相关试剂从冰箱里取出，室温解冻或 冰上解冻待用。还需要16%甲醛，5M NaCl 及RNase- free water 等 本次实验所需的耗材和仪器有：赛默飞公司的Thermo Scientific 全波长扫描 式多功能读数仪、QSP 盒装吸头及冰盒，芬兰百得公司提供的各个量程单通道移 液器，离心机，恒温水浴锅等。 接下来进入实验部分，本实验操作流程为：首先用甲醛处理细胞，使蛋白质 与DNA 交联，然后用微球菌核酸酶进行消化，进行免疫反应之后，解除蛋白质 DNA 的交联，最后回收得到的DNA 。 甲醛处理使蛋白质与DNA 交联 在实验前需将待用细胞，用胰酶消化，进行细胞计数后，调整细胞密度到所 需的密度后，方可进行实验。在含相应细胞数量的细胞悬液中，根据细胞培养基 的体积，加入16%的甲醛至终浓度为1%。 轻柔颠倒混匀，通风橱中室温孵育10min 。在含1%甲醛的培养基中加入10× Glycine Solution 至终浓度为1×，混匀，室温孵育5min ，目的是终止交联。3000 ×g 离心5min ，弃掉培养基，用适量预冷的PBS 洗细胞，离心去除废液。 重复用PBS 洗细胞两次，小心悬浮。 离心弃除废液，加入1ml 含1% Halt Cocktail 的预冷PBS ，悬浮细胞并将细 胞悬浮液转移至1.5ml 离心管中。 3000×g 离心5min 可直接进行下一步骤。 细胞裂解并用微球菌核酸酶进行消化 Micrococcal Nuclease 可以将染色质切成一到几个核小体，比常规的超声波 处理的结果更精致，更均一。另外，酶反应的条件比较温和，对 DNA 和 DNA 与蛋白的复合物的损伤较小，而且蛋白不易变性。 交联好的蛋白质与DNA 的复合物，弃上清后，加入100μl 预先准备好的已 含蛋白酶抑制剂的预冷Lysis Buffer 1 ，上下吹打至混匀，漩涡振荡15s 然后冰上 放置 10min ，9000×g 离心3min ，弃上清，用100μl 的微球菌核酸酶工作缓冲液 重新悬浮沉淀。分别往离心管中加入0.25μl 的微球菌核酸酶，上下吸打至混匀， 37℃水浴箱中孵育15min ，注意每隔5min 取出颠倒混匀。 温浴结束后加入10μl Micrococcal Nuclease Stop Solution 终止消化反应，短 暂的漩涡振荡混匀，置于冰上静置5min ，9000×g 离心3min ，弃上清，加入50μl 已含蛋白酶抑制剂的Lysis Buffer 2 ，重悬沉淀，置于冰上静置15min ，每5min 进行漩涡震荡 15s，9000×g 离心5min ，吸取上清至另一新的1.5ml 离心管中，此 时上清内含已消化好的染色质。这时可继续进行接下来的免疫沉淀反应实验，也 可以将样品冻存于-80℃中备用。 染色质免疫沉淀反应 将上一步骤得到的上清，约 50μl，转移5μl 至另一新的离心管中作为Input 对照。在剩下的45μl 上清液中加入450μl 的1× IP Dilution Buffer ，混匀。在3 个样品管中加入适量一抗，阳性对照是加入 10μl Anti RNA Polymerase two Antibody，阴性对照是加入2μl Normal Ra