四、基因工程的操作过程.pptVIP

（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程 如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素指示液选择。 2. 插入表达筛选法 将一段负调控序列重组到标记基因上游，用于抑制标记基因的表达。当外源DNA插入在负调控序列内使其失活位于下游的标记基因才能表达。 ?-半乳糖苷酶 乳糖 半乳糖 葡萄糖 Xgal 半乳糖 5-溴-4-氯靛蓝 + + 深蓝色 1. 原理： 载体上有一段?-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的?片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的?-半乳糖苷酶基因（ ?片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的?-半乳糖苷酶。 C. ?-半乳糖苷酶显色筛选 2. 选择过程 ?-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。 利用插入的外源基因的表达产物特性进行直接选择（只在特定条件下），要求克隆的基因片段至少是一个完整的基因序列，而且能在大肠杆菌中实现表达。 转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。 1.弥补缺陷 his- his+ 受体菌： 外源基因： 在不含组氨酸的培养基中生长 二、利用插入序列提供的表型特征筛选 小鼠的二氢叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。 DHFR 载体 连接 转化受体菌 三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板 含DHFR的克隆才能生长 例： 使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。 2. 增加新性状 利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大的原理。 一、直接电泳检测法 从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。 使用于较大外源DNA片段。 分子量 Marker 载体 重组克隆 第二节 依赖于重组子结构特征分析筛选法 二、酶切电泳筛选法 1. 原理： 根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。 或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是否符合预计的结果。 2.筛选过程： A B A或B 酶切电泳筛选法 不同克隆的酶切结果 三、PCR扩增检测法 1. 原理 PCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。 2. 过程 （1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。 （2）用外源DNA插入片断引物作PCR。 （3）电泳PCR产物。 （4）检查是否有PCR产物。 （5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。 1. 核酸杂交 第三节 核酸分子杂交检测法 一、原理： 重组克隆与探针杂交 3. 识别标记 32P 、 125I 、35S 、14C （1）放射性同位素： 2. 检测用的探针 与外源DNA插入片断互补的序列。 （2）非放射性标记： 荧光素、生物素、地高辛 二、核酸杂交检测方法 用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。 1. Southern blotting 从宿主细胞中提取DNA（或质粒载体），再用探针杂交。 只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。 转化率高的菌株； 有突变的菌株（与导入的载体基因互补）； 不育的菌株（不会与其他酵母接合）; 一、导入酵母细胞 1. 菌株选择 如：ura3-52, trp1-289, leu2-3, leu2-112, his3?1 重组子导入真核细胞 ——酵母菌、植物细胞、动物细胞 （1）利用原生质球进行转化 2. 酵母的转化方法 酵母 原生质体 感受态 酶去壁 CaCl2、 PEG 插入外源基因 的酵母载体 pEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 转化 酵母 0.1mol/L LiCl处理 插入外源基因的酵母载体 感受态 40% PEG 4000 （2）利用Li+盐进行转化 二 导入植物细胞 A 农杆菌介导的Ti质粒载体转化法 几乎所有的双子叶植物尤其是豆科类植物的根部常常会形成根瘤，这是由于植物根部被一种革兰氏阴性土壤杆菌农杆根瘤菌（A.tumefaciens）感染所致，其致瘤特性是由该菌细胞内的野生型质粒 Ti（Tumor-inducing）介导的。 Ti质粒的T－DNA区可携带任何外源DNA整合到植物基因组中。 转化方法： 叶盘转化法 整体植株接种转化法 原生质体共培养转化法 叶盘 消毒 切取 土壤农杆菌浸泡 看护培养基 愈伤组织 分化幼苗 叶盘法（leaf disk) 植物细胞 原生质体 纤维素酶和果胶酶 DNA 混合入电击缓冲液 1-2kV电击 愈伤组织 幼苗 分化 1. 电击法（electroporation) B 直接