胡优敏《电生理学技术及临床应用》细胞电信号研九究方法和膜片钳技术.ppt

3. 研究对象 研究对象已经不局限于离子通道。从对离子通道（配体门控性、电压门控性、第二信使介导的离子通道、机械敏感性离子通道以及缝隙连接通道等等）的研究发展到对离子泵、交换体以及可兴奋细胞的胞吞、胞吐机制的研究等。  4. 膜片钳技术的主要用途 膜片钳技术广泛用于研究细胞离子通道，已经成为研究细胞水平生理功能的常用技术。归纳其主要用途包括：1）可分辨单通道电流，直接观察通道开启和关闭的全过程。通过测得的单通道特征参数可鉴别通道类型，同时可验证和研究通道的开关动力学模型。2）单通道记录可以解释某些药物的作用机制，以研究特定药物对电压和递质依赖通道的影响。3）膜片钳的空间分辨率高，在中枢神经系统中可分离细胞体与轴突和树突的电流；在周围神经系统中可深入了解受体的分布区域，绘制细胞表面的特定离子通道的分布图。 4）“内面向外”和“外面向内”膜片记录允许任意改变膜片内外溶液成分，分别研究单一组分对通道特征的影响，避免了其他成分的干扰。而全膜片记录可用来研究常规电压钳无法研究的小型细胞，在控制细胞内一定离子浓度的同时监测整个细胞膜的电活动。这种方法已被用于采用重组DNA技术表达的通道研究。5）膜片钳技术还可用于研究第二信使的作用。 5. 应用举例 (1) 在离子通道研究中的重要作用 应用膜片钳技术可以直接观察和分辨单离子通道电流及其开闭时程、区分离子通道的离子选择性、同时可发现新的离子通道及亚型，并能在记录单细胞电流和全细胞电流的基础上进一步计算出细胞膜上的通道数和开放概率，还可以用以研究某些胞内或胞外物质对离子通道开闭及通道电流的影响等。 分辨单通道电流，直接观察通道的开闭过程； 区分离子通道的离子选择性及其门控特性(如区分电压、化学或门控性通道)，发现新的离子通道及亚型； 在记录单个通道电流(ｉ)和全细胞电流(Ｉ)的基础上，可分别计算出细胞膜上的通道数(ｎ)和开方概率(ｐ)，依公式Ｉ=ｎｉｐ； 用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片)，或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片)， 研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶Ｃ等活性变化，以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片)； 研究受体的激活态、失活态和静息态的功能； 研究不同离子强度对通道特性的影响及细胞内信使物质如1,4,5-三磷酸肌醇、环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、Ca2+等对离子通道型受体的调节机制(内面向外膜片)。 研究药物对电压和化学内控性通道的影响。 （2）对药物作用机制的研究 通过膜片钳技术对离子通道药理学的研究可观察药物对离子通道的影响、分析药物在靶离子通道或受体上的作用位点等。这是目前膜片钳技术应用最广泛的领域，既有对西药药物机制的探讨，也广泛用在重要药理的研究上。也常用于对活性药物进行筛选。 在心血管药理研究中的应用 随着膜片钳技术在心血管方面的广泛应用，对血管疾病和药物作用的认识不仅得到了不断更新，而且在其病因学与药理学方面还形成了许多新的观点。正如诺贝尔基金会在颁奖时所说：“Neher和SaKmann的贡献有利于了解不同疾病机理，为研制新的更为特效的药物开辟了道路”。 创新药物研究与高通量筛选 目前在离子通道高通量筛选中主要是进行样品量大、筛选速度占优势、信息量要求不太高的初级筛选。最近几年，分别形成了以膜片钳和荧光探针为基础的两大主流技术市场。将电生理研究信息量大、灵敏度高等特点与自动化、微量化技术相结合，产生了自动化膜片钳等一些新技术。 膜片钳技术与光学成像术的结合拓宽了膜片钳技术的应用范围。 目前广泛应用的是在用荧光探针测定细胞内游离Ca2+离子浓度的同时检测离子通道的功能改变。采用共聚焦激光扫描显微镜可动态地精确测定Ca2+浓度。荧光探针可通过膜片钳电极向细胞内注入，也可通过膜片钳电极将细胞内的荧光探针抽吸稀释掉，从而测定细胞器（线粒体、内质网等）内的游离Ca2+浓度。 （3）膜片钳技术与其它技术相结合 膜片钳的膜电容检测与碳纤电极电化学检测联合运用，之后又将光电联合检测技术与碳纤电极电化学检测技术首先结合起来。这种结合既能研究分泌机制，又能鉴别分泌物质，还能互相弥补各单种方法的不足。 Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用，可对形态相似而电活动不同的结果作出分子水平的解释，从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代：基因重组技术，膜通道蛋白重建技术。 eg.在全细胞膜片钳记录下，将单细胞内容物或整个细胞（包括细胞膜）吸入电极中，将细胞内存在的各种mRNA全部快速逆转录成cDNA，再经常规PCR扩增及待检的特异mRNA的检测，借此可对形态相似而电活动不同的结果做出分子水平的解释或为