反义核苷酸技术.ppt

反义核酸技术 一、RNAi基本概念及相关作用机制 二、siRNA序列设计及制备；脱靶效应 三、siRNA转染过程相关问题 RNA干扰(RNA interference，RNAi)是双链RNA特异性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解，从而介导转录水平基因表达抑制。 一、RNAi基本概念及相关作用机制 二、siRNA序列设计及制备；脱靶效应 三、siRNA转染过程相关问题 siRNA序列设计注意事项 1、化学合成法 2、体外转录法 3、Dicer/RNaseⅢ酶解 1、多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、 最有效的siRNA序列 2、阴性对照 3、阳性对照 4、siRNA荧光标记 siRNA制备方法 脱靶效应 定义： 影响因素 检测方法： 如何尽量避免？ 指siRNA转染中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。 基因表达谱芯片 siRNA浓度 转染试剂 2、采用不同转染试剂进行实验 1、针对同一靶基因设计2条以上抑制效率在70％以上的不同siRNA序列，分别进行实验 一、RNAi基本概念及相关作用机制 二、siRNA序列设计及制备；脱靶效应 三、siRNA转染过程相关问题 siRNA转染 方法： 转染试剂 脂质体类 非脂质体聚合物类 lipofectamineTM 2000和RNAiMAX EntransterTM 转染过程相关问题 1、细胞数量 2、siRNA浓度 3、血清 4、抗生素 5、转染后换液 6、转染条件优化 7、RNAi检测方法 化学方法，电转化 系列(EntransterTM-R) siRNA Lipofectamine? RNAiMAX Reagent Dilute Lipofectamine? RNAiMAX Reagent in Opti-MEM? medium Dilute siRNA in Opti-MEM? medium Add Diluted siRNA to Diluted Lipofectamine? RNAiMAX Reagent (1:1 ratio) cells Add siRNA-reagent complex to cells