新城疫HI抗体监测.ppt

新城疫HI抗体监测 新城疫（newcastle disease,ND）是由新城疫病毒引起禽的一种急性、热性、败血性和高度接触性传染病。以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征。具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。 病鸡是本病的主要传染源，鸡感染后临床症状出现前24小时，其口、鼻分泌物和粪便就有病毒排出。病毒存在于病鸡的所有组织器官、体液、分泌物和排泄物中。 实验目的 实验原理 实验材料 实验步骤和方法 一、实验目的 掌握新城疫的免疫监测技术 病毒的红细胞凝集现象：许多病毒表面有血凝素蛋白，能与各种动物的红细胞表面受体结合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。 96孔V型微量反应板、微量振荡器、病毒材料、红细胞悬液、生理盐水或PBS、微量移液器、注射器、抗凝剂、离心机、恒温箱等。 血清样品的采集、运送和保存 制备鸡红细胞悬液 病毒的红细胞凝集试验（HA） 病毒的红细胞凝集抑制试验（HI） 1、血清样品的采集、运送和保存 （1）血清样品的采集 颈静脉或翅静脉采血１ml左右。每个鸡群随机采集30-50份样品。 （2）样品的运送和保存 样品采集后应立即送到实验室，如实验室距离较远或一时无法立即传送时，应将样品放入冰箱4℃或装有冰块的冰壶内，尽快送检。 最好在样品采取后1~2h内送到实验室，立即进行分离血清，尽快检测。暂时不能检测时，应将样品存放在-20℃低温冰箱内保存。 *注：也可采集卵黄样品(卵黄：PBS：氯仿=1：1：2) 2、制备鸡红细胞悬液 （1） 制备1%鸡红细胞悬液： 用注射器抽取抗凝剂。 上述注射器，无菌抽取健康的3只未免疫成年鸡的血，与抗凝剂4:1混合。 混匀，加生理盐水或PBS适量，洗涤离心，共离心5次洗去血清及白细胞。 所余的纯红细胞压积，用生理盐水或PBS稀释100倍，即成1%的鸡红细胞悬液,4℃保存。 3、病毒的红细胞凝集试验（HA） （1）凝集价的测定 （2）HA方法与步骤 （3）判定结果 （1）凝集价的测定 将已知病毒材料，稀释成不同的稀释倍数，进行HA试验，出现血凝现象的各稀释孔中，能使红细胞完全凝集的病毒的最大稀释倍数者即定为凝集价。又称为该病毒的血凝滴度。 4单位病毒 即将一个血凝单位的稀释度增加4倍浓度，例如一个血凝单位为1:64，4个血凝单位则为64/4=16倍稀释。 （3）判定结果： （＋）凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的复满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。 （－）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。 4、病毒的红细胞凝集抑制试验（HI） （1）凝集抑制价的测定 （2）HI方法与步骤 （3）判定结果 （1）凝集抑制价的测定 HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。 抗体效价：出现红细胞凝集抑制现象的血清的最大稀释倍数叫抗体效价。又称该血清的 HI滴度。 鸡群 HI滴度的高低在一定程度上反映了免疫保护水平的高低。 （3）判定结果 （＋）凝集反应者，凝集的红细胞呈薄膜状，均匀的覆满孔底，有的似有红细胞沉积于中央。 （－）红细胞全部沉于孔底中央，周围无散在的红细胞。 结果分析 HI平均滴度在26以上鸡群保护率可达90%以上，24以下保护率只有50%左右。 如果鸡群中有10%的鸡出现211或者更高的抗体水平，则表明该鸡群发生了新城疫强毒感染。 * * 王晓泉　刘慧谋 高架上养鸡的肉鸡场 工厂化笼养蛋鸡场 二、实验原理 三、实验材料 四、实验步骤和方法 翅静脉 采血 25 25 25 …….. 25 25 25 生理盐水或PBS 25 25 25 …….. 25 25 25 1%红细胞悬液 …….. …….. ……. ……. 25 25 210 10 振荡混匀，室温或37℃温箱作用，10分钟开始观察，直到结果出现 弃去25 25 25 25 25 病毒（已知） 25 25 25 25 25 生理盐水或PBS 211 23 22 21 病毒稀释倍数 对照 11 3 2 1 孔号 （2）HA方法与步骤(μL) 振荡混匀，室温或37℃温箱10分钟 25 PBS 25 25 …….. 25 25 25 4单位病毒 25 25 25 …….. 25 25 25 1%红细胞悬液 …….. …….. ……. ……. 25 25 210 10 振荡混匀，室温或37℃温箱作用，10分钟开始观察，直到结果出现 弃去25 25 25 25 血清（待检） 25 25 25