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转化实验步骤 细菌转化实验原理和操作步骤 转化是指一段同源或异源的DNA转入受体细胞并得到 表达的水平基因的转移过程，是现代分子生物学研究和基 因工程不可缺少的重要技术。关键词：细菌转化细菌转化 实验目的 以pGLO质粒转化大肠杆菌为例，学习转化的基本 原理及方法。2.验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的 理解。 实验原理转化是指一段同源或异源的DNA转入受 体细胞并得到表达的水平基因的转移过程，是现代分子生 物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。目前常用的转 化方法有CaC12法和电转化法。本实验是用pGLO细菌转化 试剂盒中提供的pGLO质粒来转化大肠杆菌，所用方法为 CaC12转化法。 pGLO质粒： pGLO质粒上主要含有两个基因，一个为编码绿色荧光 蛋白的基因，一个为抗生素氨节青霉素抗性基因。此外， 该质粒还整合有一个特殊的参与受体细胞中绿色荧光蛋白 表达的基因调控体系，转化细胞中的绿色荧光蛋白基因只 有在培养基中存在阿拉伯糖时才能启动表达。转化子细胞 将在不含阿拉伯糖的培养基上呈白色而在含阿拉伯糖的培 养基上显绿色荧光，这种荧光在长波紫外灯下即可观察到。 实验材料 受体菌：HB101质粒：pG LOplasmid转化液氨节青霉素 阿拉伯糖 培养基：固体L B、液体LB接种环、移液器等四.实 验步骤 准备平板：每组：1块LB平板，2块LB/amp平板， 1块LB/amp/a ra平板2.准备感受态细胞：用250卩1无菌 水或转化液悬浮试剂盒中提供的大肠杆菌菌粉，此即感受 态细胞。 3.活化受体细胞：挑取1环HB10 1菌液，于LB培养基 上 37°C活化 16-2 4ho 细菌转化： 1?将质粒和感受态细胞从冰箱中取出，放入冰上 在无菌操作台中，将质粒1微升加入到感受态菌20- 30微升中 冰上30min,每隔5 min轻摇EP管 将混合液在42°C中热激90s,将质粒粘附在感受态 细胞表面，立即冰上静置lmi n 加入200微升LB培养基，轻轻摇匀，37°C振荡1-2h, 使菌恢复正常 6 ?涂板，倒扣平板12-24h 挑取单克隆，扩大培养37°C摇菌 提质粒 At tention：涂布平板时三角涂布棒刚烧完后记得冷却 一下 I I ! I ! I ? ? ? ? ? 涂布平板的方法：用枪将液体滴加到中间，然后从内 往外画圆稀释菌，以便最后在边缘处得到单克隆 扑灭酒精灯：盖的时候多盖几下 在倒扣平板前要先让培养基吸收菌，故先正放十几分 钟，然后再倒扣起码14h让菌张起来。这个过程中不要开 摇晃，直接3 7°C放置就好。 实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 一、实验目的 了解和掌握大肠杆菌感受态细胞的制备方法的原理 和操作要点； 质粒D NA转化大肠杆菌细胞的原理和方法.二、实验 原理 外源DNA只有转化到大肠杆菌细胞内才能得到扩增， 而大肠杆菌转化实验的技术关键就是制备感受态细胞，即 应用一些特殊方法处理后，使细菌细胞膜通透性发生暂时 的改变，处于能允许外源DNA分子进入的状态，即为感受态 细胞。 CaC12转化法的基本原理是细菌在低温，低渗的溶液中, 菌体细胞膨胀成球形，局部失去细胞壁或细胞壁溶解，外 来的DNA可形成抗DNase的疑基一钙磷酸复合物黏附于细 胞表面，经42°C短暂热冲击处理，促使DNA复合物进入细 胞，从而实现外源基因的转化。三、实验材料样品 连接了目的基因的重组体分子 细菌——大肠杆菌DH5a菌株：R, M, Amp。试剂 固体和液体培养基和含Amp的LB固体培养基；2 ?氯化 钙溶液 /L cacl2溶液：称取无水cacl2,溶于50ml水中，定 容至100ml,高压灭菌后备用。 保存液：称取无水cacl2,溶于50ml水中，加入15ml 甘油，定容至100ml,高压灭菌后备用。 氨节青霉素母液配成10 Omg/ml水溶液，-20°C保存 备用。 仪器及器材 ①超净工作台；②恒温摇床；③离心机；④V-110 0分 光光度计；⑤水浴锅；⑥微量移液器。 四、实验步骤 操作步骤 1 .感受态细胞的制备和保存 感受态细胞的制备试验步骤 转化 1?细胞的生长状态和密度。最好从-70￡或-20￡甘油 保存的菌液中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要 用已经过多次转接及贮存在4°C的培养菌液，细胞生长密度 控制在5X7 10个左右/每毫升培养液为佳，即一定采用处于对数 期或对数生长前期的细菌，密度过高或不足均会使转化率 下降。 试剂的质量。所用的试剂，如cacl 2等均需纯度最 高，如优级纯或分析纯，并用超纯水配制，灭菌后保存于 干燥的冷暗处。 质粒DNA的质量和浓度。质粒DNA的转化率与外源 DNA的浓度在一定范围内成正比，当加入的外源D NA的量 过多或体积过大时，会使转化率下降。一般情况下，