药敏试验方法及耐药菌株的检测.pptVIP

药敏试验的方法及耐药菌株检测 昆明市延安医院检验科 黄云昆 什么是抗菌药物的敏感性试验？ 测定抗菌药物在体外抑制病原微生物生长的效力，称抗菌药物对细菌的抑菌试验，或称细菌对药物的敏感性试验。 药敏试验的适应征 当某种细菌被认为是感染性疾病病原，需抗生素治疗而该细菌的药敏谱不能从其种属推知时，即须做药敏试验 正常菌群或已知目前对基本药物尚未出现耐药株的细菌不需做药敏试验. 药敏试验的目的和意义 供临床医师选用抗菌药物时的参考 细菌耐药性监测和耐药性变迁 评价新抗菌药物的药效学特征 对细菌耐药谱分析和分型有助于某些菌种的鉴定 作为医院内感染流行病学调查的手段之一 药敏试验的方法 稀释法 试管稀释法（肉汤稀释法） 平板稀释法（琼脂稀释法） 扩散法（纸片法） Kirby-Bauer(K-B)法 Stockes法 E-Test(Epsilometer test) 药敏试验的方法 自动微生物鉴定药敏系统：结果为MIC,μｇ／ml。 耐药筛选试验和折点敏感试验 联合药敏试验:两种药物的协同,无关,拮抗关系. CLSI的简单介绍 NCCLS （The National Committee for clinical laboratory Standards） – 美国临床实验室标准委员会 – 已经被我国卫生部指定为部颁标准 – 每年有新版 CLSI （Clinical and Laboratory Standards Institute） – 美国临床实验室标准化研究所 – 2005年 纸片扩散法药敏试验（K―B法） 原理：将浸有抗菌药物的纸片贴在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，因此敏感细菌在纸片周围一定距离内的生长受到抑制，形成相应的抑菌圈，其大小与该药物的最低抑菌浓度（MIC）呈负关，根据抑菌圈的大小即可推知该药物的MIC，可将药敏结果判断为敏感、中介和耐药。 K―B法药敏培养基 肠杆菌科，铜绿假单胞菌、不动杆菌属、嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱假单胞菌等非发酵菌 Mueller-Hinton （MH）琼脂，pH7.2～7.4，厚度4mm 葡萄球菌属、肠球菌属 Mueller-Hinton（MH）琼脂 肺炎链球菌、β溶血链球菌、草绿链球菌、脑膜炎奈瑟菌 5%脱纤维羊血MH琼脂 K―B法药敏培养基 嗜血杆菌属 Haemophilus Test Medium（HTM），添加SR158 或1%血红蛋白和1%X、V因子复合物MH 淋病奈瑟球菌 1%血红蛋白和1%X、V因子复合物的GC琼脂 操作程序 测试菌准备：所测菌种必须是纯的、16~24小时（对数生长期）培养物，不纯菌种需首先分纯，否则不得进行药敏试验。 操作程序 菌液浓度制备 直接菌悬液法：挑取平皿上至少3个已分纯菌落于无菌生理盐水中，制备成0.5麦氏单位(McFarland)标准的菌悬液（≈1.5×108CFU/ml），用0.5麦氏单位标准比浊管或比浊仪校正，制备好的菌悬液需15分钟内接种完毕 生长法 ：肉汤培养基增菌、校正浓度 操作程序 0.5M标准比浊管的制作：0.5mL0.048mol/L的Bacl2（1.175%w/v Bacl2·H2O）+99.5mL0.18mol/LH2SO4 (1%v/v),混匀，分装，密封，每月更换或核实。确认方法：分光光度计d=1cm、λ=625nm，OD=0.08～0.10。 操作程序 接种菌液： 用无菌且没有毒性的棉签蘸取菌液后，将棉签在管壁上轻轻旋转挤压几次，去掉多余的菌液 将蘸有菌液的棉签置于琼脂表面，从平皿最顶端开始往外均匀涂布菌液至整个平皿，然后旋转平板600 ，继续从平皿顶端开始涂布，再重复2次（共3次），最后沿平板边缘涂抹一周。 操作程序 贴抗菌药物纸片：接种好菌液的平板置室温干燥3～5分钟，待平板上的水分被琼脂完全吸收，用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面，轻压使其贴平，贴好的纸片不可再拿起，因纸片中的药物已扩散到培养基中。各纸片中心相距≥24 mm，纸片距平板边缘≥15 mm。即直径90mm平板每个≤5片 抗菌药物纸片的贮存 药敏纸片的贮存 大量长期贮存 -200C以下 常规用量 40C冰箱保存 使用前将贮存容器移至室温平衡1～2小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。 抗菌药物的选择：CLSI分组 操作程序 孵育：将贴好纸片的药敏平板放入培养箱内，平板在孵箱内最好单独摆放，如叠放不得超过2个。 操作程序 孵育条件 肠杆菌科： 35℃ ±2 ℃ ，16-18h 铜绿： 35℃ ±2 ℃ ，16-18h，囊性纤维化病人需延长至24h 不动杆菌、嗜麦芽、洋葱：20-24h 葡萄球菌：33-35 ℃（不可 35 ℃ )，金葡16-18h ,SCoN24h，OXA、MET、NAF、VAN、FOX24h 肠球菌： 35℃