普通PCR及测序PR原理分解.pptVIP

一 PCR技术;PCR概念 PCR的原理 PCR中的注意事项 PCR的主要类型;什么是PCR?;PCR反应的几个要素;72℃（延伸）;模板DNA;50℃;引物1;第1轮结束;;标准的PCR反应体系 4种dNTP混合物 各200umol/L 上下游引物 　　 各10～100pmol 模板DNA 　　　 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 　　　　　 1.5mmol/L;1）PCR反应成分;（2）Taq DNA聚合酶（Taq酶）;（3）引物 引物浓度：0.1-0.5 ?mol/L 浓度过高易导致模板与引物错配,反应特异性下降。 引物设计： （1）引物序列特异性好，与非扩增区无同源性。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布，G+C占40-60%。 （4）引物Tm在50℃-65℃之间，两条引物的Tm应接近，不能相差太大。 （5）引物内部避免形成二级结构。 ;（6）两引物间避免有互补序列。 （7）引物3’端与模板序列要严格配对，3’端避免出现3个或3个以上连续相同的碱基 ；引物 5’端无严格限制。;（4）dNTP dNTP： dATP， dTTP， dGTP， dCTP dNTP浓度取决于扩增片段的长度 四种dNTP浓度应相等 浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量 dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。;（5） Mg2+;（6）缓冲液（Buffer）;2）循环参数 变性 使双链DNA解链为单链 95oC 20-30秒 (2) 退火 退火温度由引物Tm值决定，一般为 Tm – 5~10℃ 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合;降低温度可增加反应的灵敏性。;（3）延伸 70-75oC(温度取决于聚合酶的活性） 延伸时间由扩增片段长度及DNA 聚合酶的延伸速度决定 （4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加;一个典型PCR体系;PCR的特点;4.对标本的纯度要求低： 　　不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测 ;PCR常见问题;无扩增产物 ; ; ; ; ; 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况);（一）防止污染 试剂小量分装 吸头及EP管一次性使用 器皿及工作区域要分开，无菌操作 （二）设立对照 阳性对照： 阳性模板 阴性对照： 阴性模板 试剂对照： 除模板外的所有组分;PCR的类型及应用;PCR的不同类型; 重组PCR（基因克隆）;5’;GTCC;不对称PCR 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究; ;反向PCR (reverse PCR) ;已知序列;多重PCR;原位ＰＣＲ;操作步骤 ①固定组织或细胞:将组织细胞固定于预先用四氟乙烯包被的玻片上，并用多聚甲醛处理，再灭活除去细胞内源性过氧化物酶. ②蛋白酶K消化处理:用60ug/ml的蛋白酶K将固定好的组织细胞片55℃消化处理2h后，96℃2min以灭活蛋白酶K. ③PCR扩增:在组织细胞片上，加PCR反应液，覆盖并加液体石蜡后，直接放在扩增仪的金属板上，进行PCR循环扩增.有的基因扩增仪带有专门用于原位PCR的装置. ④杂交:PCR扩增结束后，用标记的寡核苷酸探针进行原位杂交; 原位PCR的作用 既往鉴定细胞内特异序列一般采用原位杂交（ISH），但在每个细胞中目的片段的拷贝数少于10的情况下，该方法的敏感度就明显下降。而标准的PCR则可扩增出细胞内单拷贝的序列，敏感度很高，但却未能与细胞形态学研究相结合。 ISPCR则可把这两者结合起来，成为细胞学诊断中一种崭新的检测技术。利用该法可检测细胞内病毒感染、细胞内基因重排、以及分析细胞内RNA表达产物等方面发挥一定作用。在检测细胞的潜在感染方面也具有重要意义。;人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片 ;LCR连接酶链反应;; LCR的引物是两对分别互补的引物，引物长度为20～26个，以保证引物与靶序列的特异