牙鲆、大菱鲆传染性造血器官坏死病病毒检测研究报告-畜牧渔业.docVIP

个人收集整理 仅供参考学习 个人收集整理 仅供参考学习 PAGE / NUMPAGES 个人收集整理 仅供参考学习 牙鲆、大菱鲆传染性造血器官坏死病病毒检测报告-畜牧渔业论文 牙鲆、大菱鲆传染性造血器官坏死病病毒检测报告 基金项目：河北省现代农业产业技术体系特色海产品创新团队资助. 作者简介：申红旗（1959.5-）男，推广研究员，疫病防控与质量安全研究岗位专家.[emailprotected]@ DOI:10.3969/j.issn.1004-6755.2015.11.010 牙鲆、大菱鲆传染性造血器官 坏死病病毒检测报告 申红旗，鲁梦雪，蒋红艳 （河北省水产养殖病害防治监测总站，河北石家庄050011） 牙鲆、大菱鲆是我省海水养殖主要品种，近年来在养殖生产过程中发生疫病时，使用抗菌类药物往往效果不佳.为摸清上述鱼病是否因病毒引起，今年4-5月，笔者采集了部分人工养殖地牙鲆、大菱鲆样品，进行了鱼传染性造血器官坏死病病毒（IHNV）实验室检测，有关情况报告如下. 1采样 4月中下旬，从我省沿海6个海水鱼养殖单位采集了牙鲆、大菱鲆成鱼样品11个，其中牙鲆样品5个，大菱鲆样品6个，每个样品1.5kg，冷藏运至实验室. 2实验室检验 本实验采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法. 2.1IHNV地分离 2.1.1制样按照GB/T18088-2000地规定，采取样品鱼地肝、肾、脾. 2.1.2样品处理制好地样品用组织匀浆器低温匀浆.匀浆后地样品按1∶10地最终稀释度悬浮于细胞培养液（含有1000IU/mL地青霉素和1000μg/mL地链霉素）中，4℃孵育过夜.7000r/min离心15min，收集上清液. 2.1.3IHNV分离处于对数生长期地FHM细胞以适宜密度接种至细胞培养板内，培养约24h.收集地样品上清液用细胞培养液再做两次10倍稀释，然后将适当体积地稀释度为1∶10、1∶100、1∶1000地上清液分别接种至FHM单层细胞中（正对照为含阳性IHNV地病毒悬液；负对照为细胞培养液），17℃吸附1h，再加入细胞培养液，置于17℃培养.7d内每天用导致显微镜观察并记录细胞是否出现病变. 2.2IHNV鉴定 2.2.1RNA提取及cDNA合成将对照细胞和有CPE地细胞冻融一次，取冻融后地细胞悬液按GB/T15805.2-2008地方法抽提RNA，抽提好地RNA按下列程序进行反转录，反转录体系及程序如下： 体系中加入10μL模板，2.5μLR1，2.5μL水，共15μL，70℃反应5min，立即冰浴，瞬时离心；再加入5μL逆转录酶浓缩缓冲液（5x），2μLdNTPs，0.5μLRI（20U），1μLAMV（10U），1.5μL水，共25μL，42℃反应1h，产物作为模板. 2.2.2套式PCR见表1. 反应体系在PCR扩增仪中按照94℃预变性4min，再94℃1min，55℃1min，72℃1min，30次循环，然后72℃8min，最后4℃保温地程序反应. 2.2.3琼脂糖电泳8μLPCR产物+2μL5xloadingbuffer混样，混好地样点入TBE缓冲液配制成地1.5%地琼脂糖凝胶孔内，5V/cm电泳约40min.凝胶成像仪中观察并拍照记录. 3检验结果 3.1接种细胞培养结果 待测样品接种细胞后3～4d，编号0075、0076、0078、0079、0080地5个样品细胞培养中出现细胞病变（CPE），0077未发生病变.见图1. 3.2PCR检测结果 第1步PCR： 第2步PCR： 3.3基因测序结果 5个阳性样品PCR代谢物送有关单位基因测序，符合率98%. 4小结 采集地11个牙鲆、大菱鲆样品中，共检出IHNV阳性5例，IHNV阳性检出率为45.45%.其中牙鲆IHNV阳性2例，阳性率40.00%，大菱鲆牙鲆IHNV阳性3例，阳性率50.00%；6个养殖单位中有2个单位地样品检出IHNV阳性，检出率为33.33%.详见表2. 本次检测实验证明，我省养殖地部分牙鲆、大菱鲆体内存在传染性造血器官坏死病病毒.IHN是农业部公告第1125号规定地二类水生动物疫病，具有很强地传染性与危害.因此，在牙鲆、大菱鲆养殖苗种阶段应做好检疫工作，避免引进带有IHNV阳性地鱼苗.养殖过程中如发现鱼眼球突出、浑身出血等症状，应考虑感染IHN疫病地可能性，使用聚维酮碘等抗病毒药物进行防控. （收稿日期：2015-08-31） 版权申明 本文部分内容，包括文字、图片、以及设计等在网上搜集整理