课件：实验三血清γ球蛋白的分离、纯化及鉴定七年制.ppt

蛋白质的电离示意图 基本原理 1、以醋酸纤维薄膜作为支持体的一种电泳方法。 2、在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中均带负电荷，向正极移动。 3、带电荷多、分子量相对小的泳动速度快；带电荷少、分子量相对大的泳动速度慢。 ? ? 血清蛋白质乙酸纤维素薄膜电泳 ? ? ? ? 清蛋白 ?1 ?2 ? ? 加样线 加样线 纯化蛋白 对照 样品 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 点样 ： 全血清：点样一次 脱盐后的粗蛋白溶液：点样3～5次 浓缩后的纯γ－球蛋白溶液：点样3～5次 醋酸纤维素薄膜电泳 电泳条件： 电压：90－110 V； 时间：50分钟。 染 色：电泳毕，关电源。取出薄膜浸入盛有氨基黑10B染色液的染色缸中染色5分钟，用2.5 %醋酸洗脱液漂洗，直至背景呈白色。以血清蛋白图谱为对照，观察提纯物属哪种蛋白，其纯度如何？ 操作步骤： 1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。 2、点样：浸于巴比妥溶液中的薄膜，滤纸轻轻吸 干 — 半干燥态。 铅笔标记；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。 3、放入电泳槽，使膜保持水平。 4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。 5、染色：氨基黑10B染色5min。 6、漂洗：漂洗液浸洗3次，每次5-10min。 快 + 铅笔标记 ，垂直点样 保持膜不下垂 半干燥态 按泳动快慢顺序分为：清蛋白、α1、α2、β、γ—球蛋白。 注意事项： 1、区分电泳槽正负极。 2、点样处放在负极端，保持膜水平。 3、点样面朝下，以防样品蒸发。 后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析 主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求 * 色谱法是1906年俄国植物学家Michael Tswett将含有有色的植物叶子色素和溶液通过装填有白垩粒子吸附剂的柱子，企图分离它们时而发现并命名的。各种色素以不同的速率通过柱子，从而彼此分开。分离开的色素形成不同的色带而易于区分，由此得名为色谱法（Chromatography），又称层析法。 * * * 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定 刘晓如 【实验目的】 1．学习盐析法、凝胶层析和离子交换层析分离纯 化蛋白质的基本原理及应用 2．掌握醋酸纤维薄膜电泳技术的原理及应用 3．了解蛋白质分离纯化的总体思路 【实验方法】 一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度 【基本原理】 蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段之一。 不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分离纯化各种蛋白质。 分离蛋白质的方法 分离方法 沉淀法 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电学法 电泳法 等电聚焦 超速离心法 离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析 在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。 【基本原理】 本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ-球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度。 实验思路 分段盐析去除杂蛋白 凝胶层析脱盐 交联葡聚糖吸水浓缩 醋酸纤维素薄膜电泳鉴定 先粗后细 离子交换层析纯化 一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白 盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的中性盐溶液中溶解度不同，分别析出，达到彼此分离的方法。 本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉淀即为球蛋白的粗提液。 定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。 原理: 破坏蛋白质两个稳定因素： 水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 优点：蛋白质不变性，常用。 盐析法 盐析步骤 取离心管一支加入血清 2ml 加入2ml 0.9%氯化钠摇匀 边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml 上清液（主要含清蛋白）倾去 静置10min，再离心（5000转/分）10min 沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解 逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀 静置10min，再离心（5000转/分）10min 倾弃上清液（主要含α、β球蛋白） 沉淀即为初步纯化的γ－球蛋白 加入0.0175mo