GB/T 36824-2018松针红斑病菌检疫鉴定方法.pdf

ICS 65.020.01 B 16 国 中华人民共和国国家标准 GB/T 36824-2018 松针红斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of M ycos phαerellα pini E.Rostrup 2018-09-17 发布 2019-04-01 实施 国家市场监督管理总局峪非 中国国家标准化管理委员会 0(.. ' I (J GB/ T 36824-20 18 目u 昌 本标准按照GB/T 1.1-2009 给出的规则起草。 本标准由全同植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC 271）提出井归口。 本标准起草单位：中华人民共和同安徽归入境检验检疫局。 本标准主要起草人：李云飞、宗凯、姚剑、孙娟娟、华陈意、郑海松、余晓峰、陈雪娇、李刚、王满满、 谢超。 I GB/T 36824-20 18 附录 C （规范性附录） 松针红斑病菌的实时荧光PCR 检测方法 C.1 DNA 提取 C.1.1 将分离培养物置于研钵用液氮冷冻后磨碎，称取50 mg ~ 100 mg 于1. 5 mL 的灭菌离心管中，加 入 700 µL CTAB 缓冲液，振荡混匀， 置于 65 ℃泪浴 60 min - 90 min，期｜可不断混匀。 C.1.2 加入 700 1.1.L 酣 ： 三氯甲烧 ： 异戊醇（ 2 5 :24 :1） ， 振荡均匀，1 2 000 r/ mi n，离心 15 min。 C.1.3 取上清液放入另一1. 5 mL 新管中，加入等体积的异丙醇，轻轻颠倒3 次～5 次，室泪下放置1 h。 C. 1.4 12 000 r/ min 离心 10 min，弃去上清液。 C.1.5 加入 400 ,uL 70 % 乙醇榕液洗涤，12 000 r/min 离心 1 min，弃上清液，将离心管室掘下干燥 15 min。 C.1.6 加入 50 ,uL~ 100 µL TE 或ddH2 0，充分溶解后置于一20 ℃冰箱保存备用。 注： 也可使用试剂盒进行DN八 提取， 具体方法按照试剂盒说明书操作。 C.2 实时荧光PCR 检测 C.2.1 引物探针序列 松针红斑病菌实时荧光PCR 方法鉴定引物探剖序列见表C. L 表 C.1 引物序列 习｜物和探针名称 序列 MP F 5’ - CCGCCJ\GTGCTTC八ACACT-3 ’ MPR 5’－TGGGA.GGC八GG八TGJ\CG八T-3’ MP P 5’ - FAM-TGCCGGCATCC八CGC八GC-TJ\MRA-