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浅谈核酸POCT检测产品的试剂形态及制造过程 第 PAGE \* Arabic \* MERGEFORMAT 9 页第 PAGE \* Arabic \* MERGEFORMAT 9 页 浅谈核酸POCT检测产品的试剂形态及制造过程 原创：?才蕾? HYPERLINK "javascript:void(0);" 微流控解密?2017-09-15 （以下为本公众号特邀著名POCT研发人员--才蕾博士为我们讲解的试剂冻干方法和制造过程，在此对才博士表示衷心的感谢！！！） 自2010年6月第一款核酸POCT检测产品GeneXpert上市以来，七年间，陆续有十几个快速核酸检测产品面市，以图1为例，部分核酸POCT检测产品及上市时间如图所示。  图1 部分核酸POCT产品上市情况 在这些产品逐渐揭开神秘面纱时，作为科研爱好者（研发labor）都不禁会对产品中独具匠心的设计产生兴趣，并努力剖析解密。今天，我们就来扒一扒核酸检测产品中的化学试剂部分是如何存在并成为检测系统中的一员的。  核酸扩增检测试剂包括核酸提取纯化、核酸扩增与检测等几种组分，按成分来说，主要包括引物、探针（带荧光、淬灭基团或电化学检测基团等）、各种酶类、dNTP、增强剂、表面活性剂、盐以及防腐剂等。表面活性剂、盐和引物等小分子化合物只要能够保持在一定湿度、温度条件下，保存不难。但含有标记物的探针和酶类等生物大分子易降解或变性，是试剂能否稳定存在的关键。 从试剂保存形式上来说，大部分核酸POCT试剂卡/盘需要在室温下保存，这就要求化学试剂不能以液态形式存在，必须经过脱水处理，以固体形态存在。使用时，以缓冲液复溶进行后续反应。试剂脱水方式通常有两种，一种是点胶干燥，另一种是冻干珠形式。二者的比较如表1所示，下面谈一下两种形态试剂的生产过程。  表1 试剂干燥方式——点胶干燥与冻干珠比较 点胶干燥 冻干珠 制备温度 25oC或以上 0oC以下 制备方式 加热烘干 冷冻干燥 专业仪器 烘箱（可抽真空最好） 分液器，真空冷冻干燥机 特殊耗材 无 分隔器，液氮 制备成本 低 高 制备难度 低 高 优劣分析 优点：制备简单，仪器成本低； 缺点：高温可能会对酶/蛋白等产生影响，并且相对不易复溶 优点：低温冷冻干燥，最大限度的保持了酶/蛋白等的活性，且冻干样本具备疏松网状结构，复溶迅速； 缺点：制备复杂，仪器成本高，需要特殊的制备冻干珠的盛放/包装耗材 可行性分析 简单易行，一般实验室条件可做 较为复杂，需购买液滴分配装置 1、点胶干燥 点胶干燥（Dry Down）在体外诊断试剂的生产中较常见，比如血糖试纸，就是将微升级反应试剂，含酶和底物等，以加样枪/点样系统加到膜或卡上，以高于室温的温度，如45℃进行烘干。 1.1 ?制造过程 首先点胶，或称喷墨打印，即将液体用移液器分散到物体表面（通常是PCR反应腔室表面），然后至于烘箱内进行干燥。干燥分为一步法和两步法。一步法指在一个温度下干燥一定时间，两步法指分阶段温度进行干燥。下面以Biocartis公布专利内容解析两步法干燥过程。其专利中提及，先以某一温度T1（<40℃）进行干燥30min，使水等挥发物含量达到10%左右，再以温度T2（>80℃）干燥30min，然后结束干燥过程，最终液体挥发性物质含量<2%。其意义在于，T1温度较低，快速移除绝大部分的可挥发物，而尽可能减少大分子生物的降解。因为失去挥发物后，剩余部分液体变得粘稠，大分子移动性变差，减少了降解的可能。T2温度较高，尽可能地除去残留挥发物。 1.2 试剂组分 为了保证活性损失尽可能小，除核酸检测所必需的试剂外，还可以加入多糖等大分子物质，不仅是赋型剂也是活性保护剂。此外，也应考虑到非挥发类组分对于大分子稳定性的影响，包括无机盐，其在溶液中浓度低影响小，一旦水分等物质挥发掉，无机盐浓度明显升高，可能对大分子的稳定性有影响。以Biocartis一项公开专利中的成分举例，除PCR试剂外，其余组分和组成分别为：海藻糖0.15~0.3M，BSA5.5~6.5mg/ml以及甘油5~15%。 实际开发过程中，先确定PCR试剂组成后，再分别对赋型剂、保护剂以及干燥温度与时间等进行摸索，通过检测PCR产物选定最佳试剂组成。需要特别注意的是，干燥后是否易复溶对实验的影响也较大，理想状态是室温下，干燥试剂快速复溶，不需溶液反复溶解。 1.3?设备要求 点胶干燥的设备主要有移液枪/点样系统和烘箱。通常研发过程中做试剂组分与干燥条件筛选时，不需同时点很多样本，用移液枪即可。制造过程点样为了控制一致性及提高生产效率，需要用到点样系统。点样系统有许多成熟产品供选择，占有率较高的品牌是Biodot，国产品牌较少。 烘箱只要满足一定温度准确度及通风要求即可，根据干燥试剂量等选择相应干燥箱