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病原生物学实验技术课程内容 实验一 细菌的分离培养和保存 1.菌种的保存目的： ①科研：保证研究结果具备良好重复性； ②生产：制备诊断抗原和免疫血清； ③实验：质控所必需，新配置的试剂需要用标准菌株来做质控。 2.菌种保存的原理：使其生长繁殖受到抑制的休眠状态，减少菌种的变异。 3.菌种保存原则：①长期保证菌种原有性状和活力不变；②考虑保存方法的简便和经济。 4.菌种常用措施：①降低培养基营养成分；②低温、干燥、缺氧、避光；③添加保护剂。 5.菌种保存方法（保存方法、使用范围、优缺点） ⑴传代培养保存法： 优点：不需要很特殊的设备，操作容易，可随时观察细菌是否存活，是各微生物实验室采用的基本保存方法 。 缺点： ①保存期限短：需经常传代，易发生变异和杂菌污染；②细菌活力易受影响：培养基成分、温度的微小变化 ；③需定期移种：保管多种菌株时费力、费用高，占用地方多 。 防止变异的措施 ①控制传代次数：避免不必要的移种和传代； ②用典型菌落传代：每次传代时，可用平板划线分离的方法； ③选择合适的培养条件：选择一个适宜原种生长的条件可以防止菌种的衰退 ； ④选择合适的菌种保存方法：需要长期保存，应采用冻干法或液氮保存： 半固体穿刺法：适用于大多数对营养要求不高的细菌。保存期限2个月。 斜面保存法：广泛适用于细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的短期保存。 放线菌、霉菌和有芽胞的细菌2－4个月，无芽胞细菌1个月，酵母菌2个月，假单胞菌半个月 液体保存法：适用于厌氧菌（庖肉培养基）、链球菌、白喉杆菌、肺炎双球菌、钩体等。厌氧芽胞杆菌约2个月，无芽胞的细菌约3周 液体石蜡保存法：适用于保存真菌、酵母菌和放线菌，对保存细菌的效果较差。 方法：在培养成熟的菌种斜面上，加入灭菌并已将水分蒸发掉的液体石蜡，油层高过斜面末端1cm，封口后以直立状态在室温或4℃冰箱保存。 保存期可达数年。注意恢复使用时，由于菌体外仍粘有石蜡油，故生长较慢，且有粘性，一般要再移种2~3次才能得到良好的菌种 。 ⑵低温保存法 保存期限约一年，有些菌种可长达10年 对容易死亡的无芽胞厌氧菌特别适用，大多数能存活数年，对放线菌的保存也很有效 在实际应用中，本法比冷冻干燥法更为方便 注意事项： ①用此法保存细菌，菌浓度较高时，生存率高，保存期长； ②冷冻保存菌融化后，不能继续低温保存，应重新制作菌悬液后再低温保存 。 ⑶冷冻真空干燥法 原理：低温下快速将微生物细胞或孢子悬浮液冻结，然后在真空状态下使水分升华将样品干燥，使微生物处于休眠状态，得以长期保存。 除了只生菌丝不产孢子的丝状真菌不宜用此法外，其它多数微生物如病毒、细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等均可采用此法。 步骤： 优点：同时具低温、干燥、缺氧的菌种保存条件，无需经常传代，保存时间长，存活率高，变异率低，是目前最有效的菌种保存方法之一。 缺点：操作繁琐，技术要求高，需要的设备较昂贵，一般的实验室较少使用 。 ⑷液氮超低温保存法 原理：让生物细胞在液氮超低温的状态下冻结，为减少超低温冻结时所造成的损伤，要先将生物细胞悬浮在合适的保护剂中。 常用保护剂：羊(兔)全血，10%(20%)甘油，10%二甲基亚砜 优点： 适用范围最广，可保存病毒、噬菌体、立克次氏体、各种细菌、放线菌、真菌、螺旋体、丝状菌甚至动物细胞，操作简便，保存效果好，保存期限长，是目前最有效的菌种长期保存技术之一 缺点：液氮消耗量较多 6.菌种保管的注意事项 ①菌种经鉴定后，选用适当方法及时保存； ②标签牢固（编号、代次，批号，日期）； ③不同属或同属的强弱毒株不可同时在同一无菌室内操作； ④保存范围、转移、销毁要遵守卫生部规定； ⑤专人负责，每种一卡。 7.细菌的分离培养 临床常见标本初分离细菌应选用的培养基种类 8.细菌的接种方法 ①平板划线法：从混合培养物中分离单个菌落 分区划线法（含菌量多） 连续划线法（含菌量少） ②斜面接种法：纯化培养和保存菌种 ③穿刺接种法：保存菌种和观察动力 ④液体接种法：肉汤增菌和糖发酵试验 ⑤涂布接种法：菌量计数和药敏试验 9.细菌的培养方法 ①需氧培养：用于各种需氧菌和兼性厌氧，细菌检验中最常用的方法 。 ②CO2培养法：用于分离培养需要CO2气体生长的细菌，脑膜炎奈瑟菌、布鲁菌、淋球菌，烛缸法 。 ③厌氧培养：用于分离培养专性厌氧菌，焦性没食子酸法、厌氧罐法、厌氧袋法、厌氧箱培养法等 。 实验二 病毒基因组遗传进化分析 1.病毒的进化：病毒的由来、存在及其发展演变的过程、特征和规律。 2.研究病毒进化的难度：病毒特别微小；病毒没有化石；病毒进化的随机性强。 3.病毒（Virus）是形态最微小、结构最简单的微生物。因其体积微小，必须用电子显微镜放大几万至几十万倍后方可观察；结构简单表现为无完