农作物种质资源超低温保存技术规程-中国作物种质资源.PDFVIP

国家农作物种质资源平台 国家作物科学数据中心 农作物种质资源超低温保存技术规程 1 范围 本规程规定了农作物种质资源超低温长期保存的工作程序和技术要求。 本规程适用于种子、胚轴、花粉、休眠冬芽、茎尖分生组织等种质资源的超 低温保存。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本规程的引用而成为本规程的条款。凡是注日期的引 用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本规程。 然而，鼓励根据本规程达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡 是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本规程。 GB 19489-2004 生物安全通用要求 GB/T1.1-2000 标准的结构和编写规则 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本规程。 3.1 超低温保存 在液氮液相（-196℃）或液氮雾相（-150℃）中对生物器官、组织或细胞等 材料进行长期保存。其原理是植物材料的代谢和生长活动在这样低的温度条件下 几乎完全停止，因此能够有效保持材料的遗传稳定性，同时又不会丧失其形态发 生的潜能。 3.2 顽拗型种子（Recalcitrant seed） 指对干燥脱水和（或）低温敏感的种子。产生顽拗型种子的农作物大多数是 热带、亚热带的多年生木本植物，如热带的可可、椰子等作物和热带亚热带的芒 果、油梨、榴莲、红毛丹、木菠萝、荔枝、龙眼、黄皮等水果。通常种子较大， 含水量较高。这类种子对脱水伤害的反应高度敏感，采收后如果置于室内通风处， 一般只有几天或十几天的寿命；如果采用湿境贮藏一般只有几个月的寿命。同时 1 国家农作物种质资源平台 国家作物科学数据中心 这类种子对冰点以上低温敏感，易遭受冷害。 4 基本原则 超低温保存与资源的种质库保存、试管苗库保存、种质圃保存、原生境保存 等途径构成了互补的保存体系，是安全复份保存的重要方法之一。 由于物种之间，甚至是同一物种不同品种之间，其超低温保存技术差异很大， 且许多技术仍处于试验研究阶段，还未进行规模化、标准化实践验证，因此任何 作物或某一类种质材料在进行常规超低温保存之前，都应进行试验研究，并制定 出相应的操作处理程序手册。 5 仪器与常用试剂 5.1 仪器设备 (1) 用于组织、细胞和原生质体培养的全套设备，如超净工作台、高压灭菌 锅、培养瓶、培养架、光照培养箱、空调、除湿机、电子天平、pH计、电磁炉、 微波炉、酒精灯、记号笔、封口膜、坩埚钳等。 (2) 普通冰箱和―60～―80℃低温冰箱。 (3) 程序降温仪、分光光度计、光学显微镜和紫外光荧光显微镜。 (4) 铝箔袋、塑料口袋、布袋和细线绳、安瓿瓶、不锈钢冷冻筒、塑料管或 冷冻管等，容积规格为5ml或10ml等，要求封盖严密，不进液氮。 (5) 进行种子解剖、脱水、含水量测定和活力检测的仪器与工具，如解剖针、 医用剪刀、镊子、培养皿等。 (6) 蒸馏水和充足可靠的液氮（LN）源供应。液氮通常由专门的公司供应， 也可以利用每个月可生产100～900L的小型LN生产设备生产液氮。 (7) 液氮贮藏罐、操作罐和专用运输罐（通过邮寄或快运方式进行长途运输 冷冻植物材料）。YNZ-35-120 或 YDS-35-125 等型的一般液态氮冷冻罐，具有一 个抽成真空的双层壁，使装入罐内的液态氮在大气压力下保持最大限度的绝缘。 5.2 常用试剂 超低温保存常用试剂除组培常用试剂，即大量元素(硝酸钾、硝酸铵、硫酸 镁、磷酸钾、氯化钙)、微量元素（硫酸锰、硫酸锌、硼酸、碘化钾、钼酸钠、硫 2 国家农作物种质资源平台 国家作物科学数据中心 酸铜、氯化钴）、铁盐（硫酸铁、乙二胺四乙酸二钠）、有机物（甘氨酸、维生素 B 、维生素 B 、维生素 B 、烟酸、肌醇等）、蔗糖、琼脂、酒精、次氯酸钠、聚乙 1 6 2 烯吡硌烷酮、氯化汞、激素（IAA、NAA、IBA、BA等）外，还应包括：（1）用于 配制