DNA测序技术及展望.pptxVIP

杨倩倩 生命科学学院 Tel:Email: yqq@cjlu.edu.cn;第一代测序技术;第一代测序技术;DNA测序即核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 ;生命的奥秘蕴藏于 “四字天书”之中;第一代DNA测序技术： 传统的化学降解法、双脱氧链终止法以及在它们的基础上发展来的各种DNA测序技术。;1.1 化学降解法; ;碱基; 化学降解法刚问世时，准确性较好，也容易为普通研究人员所掌握，因此用得较多。 优点：即所测序列来自原DNA分子而不是酶促合成产生的拷贝，排除了合成时造成的错误。 缺点：操作过程较麻烦，且用到放射性物质，逐渐被简便快速的Sanger法所代替。;1.2 双脱氧链终止法;; PCR（聚合酶链式反应）原理; 双脱氧链终止法基本原理： DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP，ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端，终止DNA链的增长。 合成的互补链在不同位置随机终止反应，产生只差一个核苷酸的DNA分子，读取待测DNA的顺序。 ;Sanger 双脱氧末端终止法测序原理; 读出模板互补序列;; Sanger法因操作简便，得到广泛的应用。后来在此基础上发展出多种DNA测序技术，其中最重要的是荧光自动测序技术。;荧光自动化测序基本原理： ;目前所用自动测序技术的改进同位素标记到荧光标记,平板电泳到毛细管电泳;;DNA自动测序结果举例;目前所用测序技术的缺点;1.3 Sanger测序中常遇到的问题分析; 通过几十年的逐步改进, 第1 代测序仪的读长可以超过1000 bp, 原始数据的准确率可以高达99.999%, 测定每千碱基序列的成本是0.5 美元, 每天的数据通量可以达到600000 碱基。;第二代测序技术; 第一代测序技术在分子生物学研究中发挥过重要的作用，如人类基因组计划(HGP)主要基于第一代DNA测序技术。;测序设备发展现状;; 第二代测序技术将片段化的基因组DNA两侧连上接头，随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成，然后进行引物杂交和酶延伸反应。 所有克隆在同一平面上，反应大规模平行进行，每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行，从而获得测序数据。 DNA序列延伸和成像检测不断重复，最后经计算机分析获得完整的DNA序列。;第二代测序技术的特点;第二代DNA测序技术平台;Next-generation sequencing technology;2.1 454测序技术;454流程;2、Emulsion PCR： 单链DNA文库被固定在DNA捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，回收纯化 ;3、测序反应： 携带DNA片段的磁珠被放入PTP板中供测序反应使用。 ;4、数据分析： GS FLX系统在10小时的运行当中可获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息 ;454技术的主要缺点是无法准确测量同聚物的长度。 例如当待测序列中出现Poly(A)时，测序反应中会一次多加上一个T，而加入T的数目只能从荧光信号的强度来推测，有可能造成结果不准确。因而，454技术主要的错误不是来自核苷酸的替换，而是来自插入或缺失。 454技术最大的优势在于较长的读取长度，使得后继的序列拼接工作更加高效、准确。; 454生命科学公司在2005年最早推出了第二代测序平台Genome Sequencer 20，并测序了支原体Mycoplasma genitalium的基因组；2007年推出性能更优的第二代基因组测序系统一Genome Sequencer FLX System(GS FLX)。 罗氏在2005年便与454公司洽谈并购事宜，2007年完成并购，紧接着公布了DNA双螺旋的发现者之一——沃森（Jim Watson）的个人基因组，测序总花费不到一百万美元。;2.2 Solexa-Illumina Genome Analyzer;图2. Solexa测序技术流程;Solexa技术的需要的样品量低至100 ng，文库构建过程简单，减少了样品分离和制备的时间，读取长度可以达到2×75 bp。 主要的错误来源是核苷酸的替换，而不是插入或缺失，目前它的错误率大约在1-1.5 %之间。 每个循环获得20.5-25 Gb的测序结果，耗时约9.5天。 在合成中每次只能添加一个dNTP，因此很好地解决了同聚物长度的准确测量问题。;Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection 基本原理：连接反应进行