单抗电荷变异体测定法iCIEF法.PDF

单抗电荷变异体测定法 （iCIEF 法） 本法系采用全柱成像毛细管等电聚焦电泳（iCIEF)，依据不同电 荷变异体的等电点（pI）特征，按毛细管电泳法（通则0542)将其分 离 ，测定单抗产品各电荷变异体的等电点并计算相对百分含量。 全柱成像毛细管等电聚焦电泳系统 (1)检测器 紫外检测器，波长：280 nm。 (2)毛细管 涂层石英毛细管。 试剂 (1)甲基纤维素溶液 称取甲基纤维素10 g，加水溶解并稀释至1000 ml，配制成1%甲基纤维素溶液，0.22μm滤膜过滤，2～8 ℃保存。取 该溶液与超纯水以1:9稀释，配制成0.1 %甲基纤维素溶液，2～8 ℃ 保存。 (2)两性电解质（pH 3-10）。 (3)80mmol/L磷酸的0.1%甲基纤维素溶液 (4)100mmol/L氢氧化钠的0.1%甲基纤维素溶液 (5)等电点标志物（pI Marker） 所选用的等电点标志物的等电点范 围一般应涵盖供试品的等电点。 系统适用性对照品溶液的制备 采用适宜浓度的单克隆抗体作为系统适用性对照品。系统适用 性对照品应经国家药品检定机构审查、认可。 (1)用超纯水将系统适用性对照品稀释至lmg/ml。 (2)进样预混溶液制备（可根据比例一次性配制多个供试品使用的预 混溶液）： 试剂 （μL) 终浓度 两性电解质 3-10 8 4% 等电点标志物1 1 0.5% 等电点标志物2 1 0.5% 1 % 甲基纤维素溶液 70 0.35% 超纯水 80 N/A 注：样品溶液与预混溶液总体积为 200μl (3)取系统适用性对照品预稀释溶液（l mg/ml）40 μl，加入预混液 160μl，混匀，以每分钟13000转离心5分钟。取150μl上清液，转移 至进样瓶，低电压（1000 V 或1500 V）预聚焦1 min后，高电压（3000 V）聚焦7.5 min。 参比品溶液的制备 参比品系经证明足够稳定可用于鉴别、理化分析的代表批次的产 品，参照系统适用性对照品制备方法进行制备。可根据产品特征调整 参比品预混溶液体系组分或比例、终浓度、聚焦电压、聚焦时间等。 供试品溶液的制备 参照参比品溶液进行制备。可根据产品特征调整供试品预混溶液 体系组分或比例、终浓度、聚焦电压、聚焦时间等。 空白对照溶液的制备 空白对照系按照制剂配方配制,但不含有单抗的溶液。参照参比 品溶液进行制备。 测定法 取参比品/供试品溶液，按所选设备进样时间等参数自动进样， 低电压（1000 V 或1500 V）预聚焦1 min后，高电压（3000 V）聚 焦4.5 min～15 min，样品室温度为4～10 °C，毛细管温度（环境温 度）为18～25 °C。 进样顺序：系统适用性对照品溶液至少进样2针、空白对照溶液 进样1针、参比品溶液进样1针、供试品溶液1、供试品溶液2……，系 统适用性对照品至少进样1针。 系统适用性 系统适用性对照品进样应不少于3针（序列起始至少2针，序列 尾至少 1 针）且应满足主峰 pI 的标准偏差不高于 0.10 pI 单位，相 对标准偏差不高于 1.0% ；主峰百分含量的均值为 66.02%～75.54%， 标准偏差不高于 4.8%，相对标准偏差不高于 6.7%。系统适用性对照 品电泳图谱应与参考