【医学超级全核医学】第六篇.pptVIP

第六章 体外分析 定义 体外分析以放射性核素或其他非放射性物质标记的配体(Ligand)为示踪剂，以配体和结合体的结合反应为基础，在试管内进行的微量生物活性物质的检测技术。 放射分析方法或其派生的相关技术 在体外进行机体内物质种类和含量的分析测定。 测定对象是患者血清或其他体液样品内的激素、其它生物活性物质和药物浓度等。 体外分析技术建立的基础: 以配体和结合体的特异性结合反应为共同的生物学基础 以结合反应动力学规律作为共同的方法学基础 以放射性等的测量技术作为共同的定量手段 生物学基础：特异性结合反应 配体-结合体 抗原-抗体的免疫结合反应； 配基-受体的结合反应； 底物-催化酶之间的酶促反应； 　　激素-激素结合球蛋白的结合反应 方法学基础：结合反应动力学规律 遵守可逆反应的质量作用定律： k1, v1 [L]+[R] [RL] k2, v2 定量手段 (标记配体作为示踪剂) 放射性测量技术 酶定量技术 化学发光定量技术 荧光定量技术 放射免疫分析radioimmunoassay, RIA 放射免疫分析法是Yalow和Berson于1959年在研究胰岛素的时候创立的一种体外放射分析技术。 结合了放射性核素的高灵敏度和抗原抗体反应的高特异性。 一、RIA的基本原理 （一）竞争抑制结合反应： 放射免疫分析是在体外条件下，由足量的非标记抗原（Ag）与定量的标记抗原（*Ag）对限量的特异性抗体（Ab）的竞争抑制结合反应。 基本原理 （二）剂量反应曲线：标准曲线 标记物与被测物之间的函数关系可以用剂量反应曲线来表示。剂量反应曲线是用一系列标准抗原反应而绘制出来的，所以又叫标准曲线。 标准抗原(标准品)是厂家在试剂盒中提供的已知剂量的非标记抗原。 标准曲线的绘制方法 用一系列已知浓度的标准抗原和一定量的标记抗原在一定条件下同限量的特异性抗体进行反应； 在反应达到平衡后，利用适当的分离方法分离B和F； 分别测量B和F的放射性； 用反应变量（如B/F）作为纵坐标，反应剂量作为横坐标（即一系列标准抗原）作一条曲线，就得到不同浓度的标准抗原对反应变量的竞争抑制曲线，这就是剂量反应曲线。 未知样品的测量 在实际的操作中，一般要设立： 最大结合管（Bo）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为Bo。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。 非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。 总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。 标准管（B1~Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉淀的放射性作为B。 样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。 选用不同的反应变量作纵坐标，标准曲线的形状也不同。 常用的有B%，B/F，B/Bo，F/B，Bo/B等。 标准曲线左：横座标为等份刻度；右：横座标为对数刻度 （一）标准抗原 是厂家给出已知剂量的非标记抗原。 一般每一个RIA试剂盒里都有浓度由小到大的多瓶标准抗原。 标准抗原的要求： 1、标准抗原与待测抗原、标记抗原具有基本相同的免疫活性，即质同。 他们的化学结构和化学性质要相同，对特异性抗体的亲和力要相同。并且，标准抗原与待测抗原所处的介质条件要相同。 2、定量要准确： 整个RIA分析系统的定量基础就是标准抗原的量，因此标准抗原的定量一定要准确，即与国家规定的标准品相比有良好的可比性。 只有保证标准抗原的准确定量，才能保证RIA分析系统的准确度和精确度。 3、必须高纯度： 标准抗原应该含有尽可能少的化学杂质，以避免杂质对反应和计量的影响。 4、稳定性要好： 要保证在试剂盒的运输、储存和在实验过程中应该不发生降解，分离、破坏等。 （二） 标记抗原 标记抗原的要求 1、质同，即标记抗原与标准抗原、待测抗原的化学性质和免疫活性要相同。 2、标记抗原要有适当高的放射性比活度。 比活度高则在允许的相同的测量统计误差的前提下，所使用的标记抗原的量必然减少，那么在反应中与之竞争的待测抗原的量也相应减少，方法的灵敏