第二章章节基因工程制药新版本5.pptVIP

4、固定化培养 为了维持质粒的稳定性，将固定化技术和基因工程菌结合起来，进行固定化式连续培养，有利于提高生产效率。 （三）影响基因工程菌培养的各种因素 基因工程菌 传统微生物 生物材料 含外源重组基因 不含外源重组基因 发酵工艺 使外源基因高效表达 使自身基因表达 目的产物 产生外源蛋白质 产生自身的代谢 1、培养基的影响 4、溶解氧的影响 2、接种量的影响 5、诱导时机的影响 3、温度的影响 6、PH值的影响 1、培养基的影响 （1）常用碳源：葡萄糖、甘油、甘露糖、果糖。 （2）常用氮源：酵母提取物、蛋白胨、酪蛋白水解物、玉米浆、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵。 （3）其它组份：无机盐、微量元素、维生素、生物素。 （4）无机磷在许多初级代谢的酶促反应中是一个效应因子。 2、接种量的影响 接种量是指所移入的种子液体量与培养液体量的比例，它的大小会影响发酵物的产量和发酵周期。 （1）接种量小，菌体生长延迟，不利于外源基因的表达。 （2）接种量适中，生产菌能够迅速占领整个培养环境，减少菌体污染的机会。 （3）接种量过大，菌体生长过快，代谢产物积累过多，反而会抑制后期菌体的生长。 一般来说，10-15%的接种量，菌体的延迟期短、菌群迅速繁衍、很快进入对数生长期，适用于个源基因的表达。 3、温度的影响 温度对基因表达的调控作用发生在复制、转录、翻译、小分子蛋白质的合成水平等方面。 （1）在复制水平，温度可影响基因拷贝数量。 （2）在转录水平，温度可影响RNA聚合酶的作用，而来调控基因表达。 （3）在翻译水平上，还可以通过小分子蛋白质的合成水平来影响基因表达。 （4）温度还影响蛋白质的活性和包含体的形成。 4、溶解氧的影响 溶解氧对于工程菌发酵过程中的菌体代谢是有十分重要作用。细菌在大量扩增过程中，要进行消耗氧气的生化反应过程。因此，维持较高水平的溶解氧水平（DO2≥40%），才能维持工程菌的快速生长和繁衍。 采用调节搅拌转速的方法，可改善培养过程中的氧供给，提高活菌产量。 5、诱导时机的影响 对于λPL—clts875突变株工程菌来说，在28℃-30℃培养时，突变体能产生阻遏蛋白、来阻止启动子的转译。当温度升到42℃时，这种阻遏作用就消失。此时温度对于工程菌的表达起诱导作用。 一般来说，对于处在生长期后期的工程菌进行诱导，如菌体细胞密度在109个/ml时，通过升温诱导，可达到蛋白质表达增产的效果。 6、pH值的影响 pH对于细胞的正常生长、外源蛋白的高效表达都有影响。 （1）细胞生长期的最佳pH范围是6.8--7.4。 （2）外源蛋白表达的最佳pH范围是6.0--6.5。 在发酵过程中，细菌自身对pH值有一定的调节能力。当pH值超出其调节能力的范围时，会影响细菌生长。 发酵前期，pH值可控制在7.0，随着蛋白质的表达，pH值不断下降，当pH≤6.0时，应及时开动碱泵，加入碱液。 （四）基因工程菌的培养设备----发酵罐 1、发酵罐的组成 2、发酵罐的要求 1、发酵罐的组成 （1）空气加入系统----去水去油的空气压缩机 + 气体流量计 + 空气无菌过滤器 + 溶解氧电极 + 溶解氧控制系统。 （2）pH调节系统----H电极 + pH控制系统 + 酸碱补加装置。 （3）温度控制系统----热敏电极 + 温度控制系统 + 加热器 + 冷冻水浴冷却系统。 （4）消沫装置 （5）取样装置 （6）旋转搅拌装置 （7）进料系统----培养基加入口。 （8）排出系统----气体排出 + 冷却水排出 + 废料排出。 2、发酵罐的要求 （1）总体要求 （2）具体要求 （1）总体要求 （A）保证发酵环境条件恒定， （B）不影响其遗传特性， （C）不能引起所带质粒丢失。 （2）具体要求 （A）提供菌体生长的最适条件， （B）培养过程不得污染， （C）保证纯菌培养， （D）培养及消毒过程中不得游离出异物， （E）不能干扰细菌的代谢活动。 （F）发酵罐应当用不锈钢制成，表面光洁，没有灭菌死角。 （G）任何接口必须用密封圈，不得存在泄漏， （H）为避免基因工程菌在自然界扩散，培养液废物必须经过杀灭处理后才能进行排放。以免基因污染。 （五）基因工程菌发酵工艺的优化 是指形成基因工程菌发酵生产的最佳化工艺， （1）目标----最快反应周期、最高产量、最高质量、最低消耗、最大安全性、最周全的废物处理效果、最佳速度、最低失败率。 （2）具体方法----通过在不同菌种之间进行重复试验、绘制出发酵代谢曲线、从而设计出最佳工艺条件。 * 基因工程菌的培