电子显微镜讲义-TEM-XXXX(第3,4节)XXXX1127.ppt

切片与修片 超薄切片的染色 (Staining) 生物样品主要由低原子序数的轻元素组成，如碳、氢、氧、氮等。这些元素原子对电子的散射能力很弱，相互之间的差别也很小。尤其是生物超薄切片样品被树脂所包埋，这些包埋树脂对电子的散射能力与样品本身的差别很小。因此，整个样品的质量厚度差别很小，观察时像的反差很弱。这会影响像的观察及其分辨率，使生物超微结果看不清。 为了提高像的反差，除了通过电镜的操作外，更主要是通过样品染色的方法来提高样品本身的反差。这种所谓电子染色不同于光学显微镜的染色，它实际是利用某些重金属盐类（如锇酸、铅盐、铀盐等）与样品的某些成分或结构结合起来，由于重金属对电子散射能力很强，使那些与其结合的结构或成分对电子散射能力增强，从而达到提高样品本身反差的一种方法。经过染色的超薄切片不仅提高了反差，而且重金属沉淀在切片上还增加了切片对电子束损伤的抵抗力。染色还可以进行电镜组织细胞化学的研究。 硝酸铀和钨酸钠染色 RO膜聚合时间机理及结构 6.22(86.1%) lower lower higher Loose layer dense layer 支撑层 二胺单体 有机相 功能层 对于理想的染色剂应满足： 1.能强烈地增加样品反差 2.没有形成人工假像 3.不会引起细胞精细结构的畸变 4.没有细胞成分被抽提 5.染色均匀，染色时间短 6.制备和使用简单并且稳定等。 grhg 超薄切片的制作 超薄切片是在超薄切片机中进行的。要切出比较理想的超薄切片要求： 1. 一台质量好的超薄切片机外， 2. 还要有渗透、包埋良好的包埋块， 3. 合适的染色技术和效果 4.要有好的切片刀以及操作者的熟练技术等。 超薄切片的原理 超薄切片机是一种贵重的精密仪器，根据不同的进刀系统（热膨胀式和机械进刀式）分为两类超薄切片机： 热膨胀式超薄切片机是利用金属杆热胀冷缩产生长度变化的原理来进刀进行切片的，原理如下图所示，样品在样品杆的带动下快速通过锋利的刀刃，并削下样品突出刀刃的部分。由于样品杆在电热丝的加热下稳定并极其缓慢地伸长，可以有控制地切下极薄（各个型号的切片机性能有所不同，一般能切出厚度为几纳米到上百纳米的切片）的切片。切片的厚度取决于加热电流的大小，电流越大，膨胀越迅速，切片就越厚。 机械进刀式的超薄切片机 是以微动螺旋和微动杠杆来提供微小进刀而切出切片的，它操作方便，而且可以切出较大面积的切片。 1.超薄切片机 A.切片机的分类： 低温切片机和常温切片机。 B.适用范围： 主要用于高分子、生物等样品的制作。 C.超薄切片机使用方法： a.常温切片机：将样品包埋或制成5mm直 径的样条，使用切片机将样品切在水槽内，用微栅捞起即可，用于Tg高于60℃。 b.低温切片机：将弹性样品制成2～2.5mm的样条放入切片机中。待样品、刀、腔室均达到－100℃以下，即可制作样品。 我们的超薄切片机 厂家：美国RMC公司 型号：Powertome XL 基本技术参数： 切片厚度：1-999nm 切削速度：0.1-49.9mm/sec 切削区域：0-15mm,控制精度0.05mm. 切片之前的准备工作 ——包埋剂配制、样品渗透和包埋、样品固化。 渗透和包埋的目的是使包埋剂逐步渗透入组织细胞内，以便与细胞外的包埋剂同时聚合，保证能切出质量优良的超薄切片。 包埋液的基本要求： 1. 硬度适宜而且均一,有良好的切割性能，目前通用的包埋剂切割性能都很好。一般来说，Epon和非极性丙烯酸树脂的切割性能要比低粘度的环氧树脂（如Spurr等）以及极性丙烯酸树脂（如Lowicryl K4M等）好 ； 2.有足够的低粘度，以保证能自由地渗入样品 ； 3.对样品的伤害不大，聚合前后体积变化不大，环氧树脂聚合前后体积变化不大（体积大约收缩2%），而丙烯酸树脂收缩相对大一些（体积收缩15-20%体积 ； 4.能经受电子束轰击 ； 5.透明度好，高倍电镜下不显示本身任何微细结构 ； 6.毒性低，使用方便，但目前使用的包埋剂在聚合之前都有毒，操作时要注意 。 常用包埋剂及配方 根据上述对包埋剂的要求，目前在电镜技术上使用的包埋剂种类颇多，主要： 1.普遍使用的是环氧树脂， 2.丙烯酸树脂(在免疫和细胞化学技术中会使用到)。 环氧树脂（epoxy resin） 环氧树脂是一类具有末端环氧基的甘油多聚酯。它的分子中有两种反应基团，即环氧基团（epoxide group）和氢氧基团（hydroxyl group）。其末端基团易与含有活性氢原子的化合物如胺类（如DM