HXY-第四章-的基因的获取.pptVIP

反转录酶 （3）cDNA的合成 ① cDNA第一链合成 逆转录酶能以RNA为模板合成DNA。 用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 5’ AAAAAAA TTTTTTT Oligo dT引物 用碱处理或用RNaseH降解mRNA-DNA杂交分子中的mRNA。 mRNA cDNA 3’ 3’ 5’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 3’ 5’ 5’ 引物 cDNA第一链 3’ 5’ 引物 ② 降解mRNA模板 或RNaseH 碱 方法一：剩下的cDNA单链的3’末端一般形成一个弯回来的双链发卡结构（机理不明），可成为合成第二条cDNA链的引物。用DNA聚合酶合成第二链DNA.。 cDNA第一链 5’ cDNA第二链合成 DNA聚合酶 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ ③ cDNA第二链合成 这种酶能识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断。 方法二：妙用RNaseH 小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断。 DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链。 mRNA cDNA 3’ 5’ 反转录酶 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ 引物 mRNA cDNA第一链 3’ 5’ mRNA mRNA DNA 聚合酶 DNA 聚合酶 cDNA第二链 cDNA第一链 3’ 5’ RNaseH DNA ligase 去引物 ④去掉发卡结构 核酸酶S1 用核酸酶S1可以切掉发卡结构（但这会导致cDNA中有用的序列被切掉！）。 cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ cDNA第一链 cDNA第二链 5’ 3’ 5’ 3’ 在双链cDNA末端接上人工接头，即可与载体连接，转入受体菌。 或借助末端转移酶给载体和双链cDNA的3’端分别加上几个C或G，成为粘性末端。 5.cDNA与载体连接： 接上人工接头 粘性末端 CCC CCC 末端转移酶 6. cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。 N= ln (1-p) ln (1- ) p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%） : 某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例 N：所需的重组载体数（克隆数） 1 n 1 n 三、文库的查询（screening） 用目的基因探针与文库中的重组载体进行Southern blot杂交。 文库 载体 探针 电泳后杂交放射自显影 测序分析 第四节 目的基因的分离和扩增 一、目的基因的分离 1. 探针柱分离特异mRNA 根据已知的基因序列合成探针，结合到纤维素柱上，用来分离纯化该基因的mRNA。 富集特定基因的mRNA或cDNA模板。 纤 维 柱 探针DNA 探针DNA 探针DNA 探针DNA Total mRNA 纤 维 柱 探针DNA 探针DNA 探针DNA 探针DNA 过柱 与探针碱基互补的mRNA结合到柱上，其它mRNA流走。 特异mRNA 洗脱 RT-PCR 2. mRNA消解杂交 原理： 羟基磷灰石柱 结合单链DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。 （Hydroxylapatite column） 从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。 将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。 不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。 用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。 A A A组织 B组织 总mRNA（A） 总mRNA（B） 含蛋白A的mRNA 不含蛋白A的mRNA 总cDNA第一链 A 杂交 内含蛋白A 的cDNA 羟磷灰石柱 过柱 吸收RNA-DNA 单链滤过 羟磷灰石柱 B A PCR 16 cDNA文库 3. mRNA差异显示PCR（DD RT-PCR） mRNA differential display RT-PCR （1）3’端的锚定引物 Oligo(dT)引物的3’端加两个核苷酸（倒数第二个不再是T）。 AAAAAAAAAAAAAAAA mRNA 3’ 5’ NM TTTTTTTT M：A、G or C N: A、G、T or C 5’ 3’ （2）12种锚定引物 AG TTTTTTTT 5’ 3’ CG TTTTTTTT 5’ 3’ GG TTTTTTTT 5’ 3’ TG TTTTTTTT 5’ 3’