鸡堆型艾美耳球虫Hsp90增强型核酸疫苗免疫保护研究-基础兽医学专业论文.docxVIP

Classified Classified Index： Code：10224 Confidential(yes／no)：no N0．：120610416 Dissertation for the Master Degree Immune protection of enhancing DNA vaccine of0I丘．E acervulinaace a l-lSpgO genegene Candidate：Feng Li Supervisor：Professor Li Guangxing Degree Category：Master ofAgriculture C ollege：College of Veterinary Medicine First level discipline：Veterinary Medicine Second level discipline：Basic Veterinary Medicine Harbin China June 2015 万方数据 目 目 录 目 录 摘要 ．．I 英文摘要 ．．IlI 1弓I言 ．1 1．1鸡球虫病研究进展 ．1 1．1．1鸡球虫病流行情况 l 1．1．2鸡球虫生活史 1 ¨．3鸡抗球虫免疫应答 2 1．1．4 DNA疫苗在球虫免疫中的应用 ．4 1．2 Hsp90研究进展 4 1．2．1 Hsp90发现与功能 4 1．2．2 Hsp90在原虫中的研究进展 ．5 1．3鸡IL．1 8研究进展 5 1．3．1鸡IL．18研究概况 5 1．3．2鸡IL．18抗球虫免疫佐剂作用 6 1．4研究目的与意义 ．．6 2材料与方法 8 2．1实验材料 8 2．1．1实验动物与虫种 8 2．1．2载体、菌株与细胞 8 2．1．3主要试剂 8 2．1．4主要试剂配方 一8 2．1．5实验仪器 ．1l 2．2实验方法 11 2．2．1堆型艾美耳球虫Hsp90基因的克隆与鉴定 ．．11 2．2．2 Hsp90的原核表达及鉴定 15 2．2．3 Hsp90多克隆抗体的制各及其生物学活性测定 19 2．2．4 Hsp90真核表达质粒的构建、鉴定及体外瞬时转染 ．20 2．2．5真核表达质粒的大量制备与纯化 21 2．2．6实验动物分组与免疫 22 2．2．7淋巴细胞增殖实验 ．．23 2．2．8免疫及攻虫后雏鸡增重效果评价 一25 2．2．9十二指肠病变计分 ．．25 2．2．1 0抗球虫指数计算 ．．25 2．2．11 ELISA检测血液中抗Hsp90的IgG抗体 ．26 2．2．12数据处理 ．．26 I 万方数据 东北农业大学农学硕士学位论文3结果 东北农业大学农学硕士学位论文 3结果 ．．27 3．1堆型艾美耳球虫Hsp90基因的克隆与鉴定 ．27 3．1．1 Hsp90基因的克隆 ．27 3．1．2 pMDl8．T-Hsp90重组质粒鉴定 27 3．2兔抗Hsp90多克隆抗体的制备 29 3．2．1 pET30a．Hsp90重组质粒的构建与鉴定 ．．29 3．2．2表达产物的SDS—PAGE鉴定 ．29 3．2．3表达产物的Western blot检测 ．．31 3．2．4 Hsp90重组蛋白的纯化 31 3．2．5多克隆抗体的反应性和特异性检测 一32 3．3重组真核表达质粒的构建和鉴定 33 3．3．1 pVAX．Hsp90的酶切鉴定 33 3-3．2 pVAX．ILl 8-Hsp90的PCR和酶切鉴定 33 3．3．3重组真核表达质粒的测序 ．33 3．4 pVAX—Hsp90和pVAX-ILl 8-Hsp90的体外瞬时表达 34 3．5雏鸡免疫器官及外周血T淋巴细胞增殖功能变化 ．36 3．5．1胸腺T淋巴细胞增殖功能变化 ．36 3．5．2脾脏T淋巴细胞增殖功能变化 ．37 3．5-3外周血T淋巴细胞增殖功能变化 一38 3．6雏鸡免疫器官及外周血B淋巴细胞增殖功能变化 ．39 3．6．1脾脏B淋巴细胞增殖功能变化 ．39 3．6．2外周血B淋巴细胞增殖功能变化 ．40 3．7 Hsp90刺激雏鸡免疫器官和外周血淋巴细胞增殖功能变化 41 3。7．1 Hsp90刺激胸腺淋巴细胞增殖功能变化 41 3．7．2 Hsp90刺激脾脏淋巴细胞增殖功能变化 42 3．7．3 Hsp90刺激外周血淋巴细胞增殖功能变化 43 3-8外周血中IgG抗体含量动态变化 ．44 3．9重组真核表达质粒抗球虫保护效果 45 3．9，l雏鸡增重情况 45 3．9．2克粪便卵囊排出数与十二指肠病变计分 ．．45 3．9．3重组真核表达质粒的抗球虫指数 ．．46 4讨{仑 47 4．1堆型艾美耳球虫Hsp90抗原性研究 47 4．2