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TOC \o 1-3 \h \u HYPERLINK \l _Toc21072 微生物检验方法验证方案 PAGEREF _Toc21072 ① HYPERLINK \l _Toc24209 微生物限度检验方法验证方案 PAGEREF _Toc24209 ④ HYPERLINK \l _Toc3959 药品微生物限度检查方法验证方案 PAGEREF _Toc3959 ⑧ HYPERLINK /p-740666151.html \o 微生物检验方法验证方案 \t /docin_p_end 微生物检验方法验证方案 一 概 述：通过验证以确认所采用的微生物限度检测方法适合于湖南金旺稀贵药业有限公司所生产原料药的细菌、霉菌及酵母菌的测定；确认所采用的方法适合于所生产原料药的控制菌的检查。根据样品特性制定检验方法和检验条件按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 二 目 的：通过验证确认所采用的方法适合于所生产原料药的微生物限度的测定。 三 适用范围：本方案适用于本公司生产的四种原料药的微生物限度检验方法的验证。 四 责 任 人：验证小组成员及相关人员。 五 验证方案内容： 1.大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黑曲菌、白色念珠菌为验证用菌株。大肠埃希菌为革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，枯草芽孢杆菌为产芽孢杆菌，这三种菌株为细菌计数验证用菌株；黑曲菌为霉菌，白色念珠菌为酵母菌，作为霉菌和酵母菌计数验证用菌株。 验证用菌株的传代次数不得才超过5代。 细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证 1.1当建立药品的微生物限度检查时，应进行细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认所采用的方法适用于该药品的细菌、霉菌及酵母菌的测定。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌级数同时进行。 1.2 验证菌菌液制备 1.2.1 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml营养琼脂培养基中，35～37℃培养18～24小时。取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬浮液。 1.2.2 白色念珠菌菌液制备：接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基中，23～28℃培养24～28小时；取此培养液1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法稀释至10-6～10-7，制成每1ml含菌数50～100cfu的孢子悬浮液。 1.2.3 黑曲菌菌液制备：接种黑曲菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，23～28℃培养5～7天，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试管中，取1ml加无菌氯化钠溶液9ml，采用10倍递增稀释法，稀释至10-4～10-6，制成每1ml含数50～100cfu的孢子悬液。 1.3 供试液的制备 1.3.1 无抑菌活性的供试品供试液的制备 稀释剂：PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液 液体供试品：供试品10ml置锥形瓶中，加90ml稀释剂，混匀，作为供试液 （1：10）。 固体、半固体、粘稠性供试品：称取供试品10g置锥形瓶中，加稀释剂至100ml，混匀后，作为供试液（1：10）。 1.3.2 具有抑菌活性的供试品试液的制备 当供试品具有抑菌活性时，须先消除抑菌活性，其方法如下： 培养基稀释法：取供试液2ml，没0.2ml的供试液注一皿或每0.1ml的供试液注一皿；或取供试液1ml每0.5ml的供试液注一皿，倾注15ml的培养基，测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数，混匀，凝固，培养。每1ml供试液所注的平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数。计算每1ml供试液的平均菌落数，按平皿法技术规则报告菌数。控制菌检查时可加大增菌液的用量。 离心沉淀集菌法：取一定量的供试液，3000转/分离心20分钟（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5分钟，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释液补至原量。 薄膜过滤法：取规定量试验可能用的最低稀释剂供试液，过滤，冲洗吗，按薄膜过滤法测定其菌落数。 中和法：选取适宜的中和剂消除供试品的抑菌活性后测定。 1.4 菌液组：测定所加的试验菌数。采用平皿法，取试验用的1ml菌液（约50～100cfu）分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。 1.5 试验组 1.5.1 平皿法：取试验可能用的最低稀释级1ml供试液和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾入培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌落数。 1.5.2培养基稀