基因工程制药工艺.pptxVIP

生物制药工程;第六章 基因工程制药工艺;基因工程技术—基因重组示意图;6.2 基因工程大肠杆菌的构建技术;6.2.1 工程菌构建流程;6.2.2 目标基因的克隆策略;基因克隆方法的选择;PCR技术;在引物指导下，以DNA为模板，由DNA聚合酶催化的扩增特定DNA序列聚合延伸形成互补序列的反应。;PCR单反应原理与过程;PCR扩增的反应体系组成;PCR扩增产物电泳;6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程;6.2.2 RT-PCR克隆目的基因流程;1 提取RNA;总RNA提取操作步骤 ： 1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5 min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。 2、12,000 rpm 离心5 min，弃沉淀。 3、按200 ?l氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15 min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。 4、4℃ 12,000 g离心15 min。 5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱，若只提RNA，则弃下层酚相。 ;6、按0.5 ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇混匀，室温放置5~10 min。 7、4℃ 12,000 g离心10 min，弃上清，RNA沉于管底。 8、按1 ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。 9、 4℃ 8,000g离心5 min，尽量弃上清。 10、室温晾干或真空干燥5~10 min。 注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。 11、可用50 ?l H2O，TE buffer溶解RNA样品，55~60℃,5~10min。注：H2O、TE须用DEPC处理并高压。 ;RNA提取注意事项;2. 转cDNA（防RNA酶）;3. 引物设计;1）长度15~30 bp 2）AT:GC 约50%， 两引物Tm值接近，55~88℃之间。退火温度＝ Tm (4GC＋2AT)－5 3）引物3’末端以G/C结尾较好 4）不形成引物二聚体 5）特异性, 作BLAST搜索 6）简并引物：保守序列；简并度低；具单一密码子 的氨基酸放在3 ’端 7）逆向引物要用互补序列; 1）特异性引物设计;; F：XXXF，5’-? ? ? ? ? ?XXXXXX atggccgcttcgcgtgcaacg-3’ atggccgctt cgcgtgcaac gtttgttgcg ctcgtgtgcg ctctcgcgct cgccgccgcc gatgtgcaga atccgctcag tgacgatttc atcaatctca tcaacacaaa gcaaaactct ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- aacgaagtca gggaccaggg atcttgtggt agctgctggg gttcggtgc tgtggaggcc atgaccgacc ggtactgtac atactccaat ggaactcaac acttccattt ctccgctga tcagcggagaaatggaagtgt-3’ R：XXXR，5’- ? ? ? ? ? ? XXXXXX;2） 根据蛋白质同源序列设计简并引物;用DNAMAN进行同源比对,设计引物;4. RT-PCR 扩增目的基因;PCR循环;6.2.3 酶切、连接、转化、筛选;分析基因的限制性内切酶谱，确定插入质粒的限制性内切酶位点 atgaactgtgtttg ccgcctggtc ctggtcgtgc tgagcctgtg gccagataca gctgtcgccc ctgggccacc acctggcccc cctcgagttt ccccagaccc tcgggccgag ctggacagca ccgtgctcct gacccgctct ctcctggcgg acacgcggca gctggctgca cagctgaggg acaaattccc agctgacggg gaccacaacc tggattccct gcccaccctg gccatgagtg cgggggcact gggagctc