扫描电子显微镜的样品制备技术.ppt

第六章 扫描电子显微镜的样品制备技术 6.1 SEM样品制备的基本要求 SEM对样品基本要求： 基本性质：干净、干燥、导电、不发光、 不发热、磁性弱。 大 小：直径最大不宜超过10 mm，高度在3-5 mm之间，在满足观察的情况下，样品尽量小为宜。 对试样的要求试样可以是块状或粉末颗粒，试样大小要适合仪器专用样品座的尺寸，不能过大。样品座尺寸各仪器不尽相同，一般小的样品座为 Φ 3 ～ 5mm ，大的样品座为 Φ 30 ～ 50mm ，以分别用来放置不同大小的试样，样品的高度也有一定的限制，一般在 5 ～ 10mm 左右。 表面受到污染的试样，要在不破坏试样表面结构的前提下进行适当清洗，然后干燥。 新断开的断口或断面，一般不需要进行处理，以免破坏断口或表面的结构状态。有些试样的表面、断口需要进行适当的侵蚀，才能暴露某些结构细节，则在侵蚀后应将表面或断口清洗干净，然后烘干。 要求在真空中能保持稳定，含有水分的试样应先干燥除去水分。 对磁性试样要预先去磁，以免观察时电子束受到磁场的影响。 要求导电，不导电的观察前进行导电处理。 6.1.2块状试样的制备 块状试样扫描电镜的试样制备是比较简便的。对于块状导电材料，除了大小要适合仪器样品座尺寸外，基本上不需要进行什么制备，用导电胶把试样粘结在样品座上，即可放在扫描电镜中观察。对于块状的非导电或导电性较差的材料，要先进行镀膜处理，在材料表面形成一层导电膜。以避免电荷积累，影响图象质量。并可防止试样的热损伤。 6.1.3粉体试样的制备 粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上，用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。 对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时，将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散，再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上，待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附力即可粘附在样品座上。 在制备SEM样品时，必须掌握以下原则： (1)每一操作过程，都应注意防止样品的污染和损伤，使被观察的样品尽可能保持原有的外貌和微细结构； (2)去除样品内水份，以利于维持SEM的真空度和防止镜筒的污染。但在脱水和干燥处理时，要尽量减少避免样品体积变小和收缩变形等人工假象；　　 (3)降低样品表面的电阻率，增加样品的导电性能，以提高二次电子发射率，建立适度的反差和减少样品的充放电效应；　 (4)观察组织细胞的表面或内部微结构，应注意和保护样品的观察面。 6.1.4常规生物样品制备技术 制备过程如下： ①取材 根据需要，切取适当大小的样品。专门的SEM备有灵活可动，范围较大的样品台，样品可大些。装在透射电镜上的扫描附件，活动范围较小，样品直径应在3～4mm左右。 ②漂洗 用缓冲液把组织表面洗净，否则会影响正常形态，但以快速和轻巧为宜，尽量保护器官或组织的表面结构，使其不致因不慎的操作造成人为损伤。 ③固定 用2.5～5％戊二醛/缓冲液在室温或4摄氏度下前固定。具体时间可根据样品的需要而定，一般单细胞10-30分钟，较大的或较硬的样品可达1-2h或更长时间。 ④漂洗 用缓冲液洗3次，洗去未结合的戊二醛。 ⑤重固定 1％锇酸/缓冲液4摄氏度下后固定10～60min。有时为了提高样品的反差和固定效果，可以综合固定液，如随意选用戊二醛、多聚甲醛、锇酸等按照不同的比例混合使用。 ⑥漂洗 用缓冲液洗去未结合的锇酸。 ⑦脱水 用30％、50％、70％、80％、90％、95％、100％、100％丙酮或乙醇溶液各10-15分钟，大于1mm的样品可脱水10～20分钟。 ⑧干燥 一般情况下，可把脱水后的样品放在空气中自然干燥或45℃热风吹干。有些研究工作要求尽量完好保存样品表面的精细结构，可用真空干燥法、冷冻干燥法和临界点干燥法等使样品干燥。这些方法都比空气干燥法效果好，其中临界点干燥法优点多，多被研究工作者采用。 ⑨导电 ：离子溅射、真空镀膜或导电染色处理 6.2.1固定与脱水 样品的固定：为了把生物样品的微细结构和外部形态真实的保留下来，SEM样品必须进行固定处理。通过固定还可以使组织硬化，从而增强样品在干燥过程中耐受表面张力变化发生龟裂，还能提高样品耐受电子束轰击的能力。常用的固定剂为醛类和四氧化锇，还有多聚甲醛和高锰酸钾等。固定的方式有浸泡固定、灌注固定、微波和化学混合固定。 脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中的水分。 6.2.2 样品的干燥： 1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列