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elisa测抗原实验报告 　　ELISA原理－－操作规则　　酶联免疫吸附实验ELISA　　一．实验目的　　酶联免疫吸附测定是在免疫酶技术的基础上发展起来的一种新型的免疫测定技术,ELISA过程包括抗原吸附在固相载体上称为包被，加待测抗体,再加相应酶标记抗体,生成抗原－－待测抗体－－酶标记抗体的复合物，再与该酶的底物反应生成有色产物。借助分光光度计的光吸收计算抗体的量。待测抗体的定量与有色产生成正比。　　二．实验原理　　用于免疫酶技术的酶有很多，如过氧化物酶，碱性磷酸酯酶，β－Ｄ－半乳糖苷酶，葡萄糖氧化酶，碳酸酐酶，乙酰胆碱酯酶，6－磷酸葡萄糖脱氧酶等。常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶，碱性磷酸酯酶等，其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶摧化的是氧化还原反应，在呈色后须立刻测定，否则空气中的氧化作用使颜色加深，无法准确地定量。　　辣根过氧化物酶是一种糖蛋白，每个分子含有一个氯化血红素区作辅基。酶的浓度和纯度常以辅基的含量表示。氯化血红素辅基的最大吸收峰是403nm，HRP酶蛋白的最大吸收峰是275nm，所以酶的浓度和纯度计算式是＝25，式中1％指HRP百分浓度为100ml含酶蛋白1g，即10mg/ml，所以，酶浓度以mg/ml计算是HRP的AHRP纯度=A403nm/A275nm纯度RZ值越大说明酶内所含杂质越少。高纯度HRP的RZ值在左右，最高可达。用于ELISA检测的HRP的RZ值要求在以上。　　ELISA的基本原理有三条：　　抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，可能是蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附，并保持其免疫学活性；　　抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；　　酶结合物与相应抗原或抗体结合后，可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在，而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的，因此，可以按底物显色的程度显示试验结果。　　ELISA法是免疫诊断中的一项新技术，现已成功地应用于多种病原微生物所引起的传染病、寄生虫病及非传染病等方面的免疫诊断。也已应用于大分子抗原和小分子抗原的定量测定，根据已经使用的结果，认为ELISA法具有灵敏、特异、简单、快速、稳定及易于自动化操作等特点。不仅适用于临床标本的检查，而且由于一天之内可以检查几百甚至上千份标本,因此，也适合于血清流行病学调查。本法不仅可以用来测定抗体，而且也可用于测定体液中的循环抗原，所以也是一种早期诊断的良好方法。因此ELISA法在生物医学各领域的应用范围日益扩大，可概括四个方面：1、免疫酶染色各种细胞内成份的定位。2、研究抗酶抗体的合成。3、显现微量的免疫沉淀反应。4、定量检测体液中抗原或抗体成份。　　基本方法一用于检测未知抗原的双抗体夹心法:　　1.包被：用PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含(来自:写论文网:elisa测抗原实验报告)量为1～10μg／ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。。　　2.加样：加一定稀释的待检样品于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。。　　3.加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体。37℃孵育～1小时，洗涤。　　4.加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液，37℃10～30分钟。　　5.终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸。　　6.结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D　　值：在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性。　　基本方法二用于检测未知抗体的间接法：　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg／ml，每孔加，4℃过夜。次日洗涤3次。↓　　加一定稀释的待检样品于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。↓　　于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。↓　　其余步骤同“双抗体夹心法”的4、5、6。　　酶与底物　　酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物。　　免疫技术常用的酶及其底物　　*终止剂为2mol/LH2SO4　　**终止剂为2mol/L柠檬酸，不同的底物有不同的终止剂。　　可催化下列反应：HRP+H2O2→复合物复合物+AH2→过氧化物酶+H2O+AAH2——为无色底物,供氢体；A——为有