第三章 口腔疾病分子生物学.pptVIP

原核生物基因文库的建立 提取细胞DNA 限制性内切酶酶切 DNA片段连接至质粒或噬菌体 转化宿主细胞（大肠杆菌） 目的基因的筛选 核酸杂交 免疫学检测 目的基因的分析 DNA序列 启动子分析 推测蛋白质一级结构 推测蛋白质二级结构 * * 质 粒 细胞内独立于染色体外的环状DNA，能自我复制 其上基因可借助宿主细胞的转录、翻译系统得以表达 分子2000~50000bp T pGEM?-T Vector (3003bp) Ampr lacZ ori XmnI 1994 ScaI 1875 NaeI 2695 ApaI AatII SphI BstZI NcoI SacII T7 SpeI NotI BstZI PstI SaLI NdeI SacI BstXI NsiI SP6 T 1 start 14 20 26 31 37 46 55 62 62 73 75 82 94 103 112 126 pGEM-T vector map XhoI SmaI XhoI SmaI XhoI SmaI pCI pCIA-P pGEM-T/A-P A-P fragment Sub-cloning construction of recombinant pCIA-P insertion of A-P DNA fragment into plasmid pCI XhoI SmaI T4 Ligase A-P fragment 构建质粒的特点 Ori区：复制起点 Par区：保证质粒均匀分布于子细胞 多克隆区：人为构建，便于克隆操作 选择因子：含特定基因，如耐抗生素基因，使克隆后便于挑选 接 合 在适当的条件下，雄性菌和雌性菌混合时形成配对的雄性-雌性菌，并有遗传物质的单向转移。 雄性菌：含F性因子，染色体外环状DNA 转 化 外源DNA能进入细胞内并通过整合至宿主DNA中或独立复制保存于宿主细胞内。 转 录 利用噬菌体为媒介，将供体DNA转移到受体菌内的现象，能在自然状态下发生。 分子克隆常用技术 DNA电泳 基因转移 核酸杂交 聚合酶链反应PCR DNA电泳 可分离不同分子量的DNA Ladder 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Ladder 对临床菌株的第二次PCR 扩增产物电泳图谱分析 Lane 1~7: 临床菌株S. sobrinus; Lane 8~14:临床菌株 S.mutans. (Kb) 2.0 1.0 0.25 0.1 0.75 0.5 MW 核酸杂交 原理： 在一定条件下（温度、pH值等）DNA双股螺旋可解开并分离 在一定条件下，两股游离的互补的核苷酸可自行配对形成双股 Southern Blot 电泳、转移、杂交 确定分子量 斑点杂交 目标序列的存在 目标序列的量 聚合酶链反应PCR 与龋病相关微生物的定量检测方法 细菌形态 生化反应 免疫反应 分子生物学方法 ----分子探针杂交 ----RFLP ----PCR 唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 在人类口腔中检出率很高 茸毛链球菌可能比变形链球菌与龋损活跃性之间的关系更密切 变形链球菌和茸毛链球菌 唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 套式PCR快速检测人类唾液中变形链球菌和茸毛链球菌. 谭海平，边专，樊明文，陈智，范兵. 中华口腔医学杂志，2003，38：223-226 唾液在与龋病相关微生物检测中的应用 套式PCR(Nested PCR ) 5′ 3′ Template Outer primer2 Outer primer1 The first PCR 5′ 3′ Inter primer2 Inter primer 1 Next template The second PCR 5′ 3′ The second PCR product 本套式PCR的引物是分别根据变形链球菌gtfB基因和茸毛链球菌gtfI基因设计的内、外两套引物（outer primer,inter primer） gtfB gene of S.mutans Outer primer thp4 Outer primer thp3 The first PCR Inter primer thp8 Inter primer thp7 Outer primer thp6 gtfI gene of S.sobrinus Outer primer thp5 The first PCR Inter pri