免疫原于抗血清的制备实验报告.docx

免疫原于抗血清的制备实验报告 　　第一章抗血清的制备　　具有免疫原性的抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。由于抗原分子表面的不同决定簇为不同特异性的B细胞克隆所识别，因此由某一抗原刺激机体后产生的抗体，实际上为针对该抗原分子表面不同决定簇的抗体混合物(即多克隆抗体)。　　第一节抗原的制备　　一、概述　　免疫原性引起机体免疫反应的能力，包括特异免疫球蛋白的形成和特异淋巴细胞的产生两个方面。　　抗原性指抗原能够诱导免疫应答以及与特异免疫球蛋白和特异效应淋巴细胞结合和反应的能力。　　二、免疫原的制备　　细胞性免疫原的制备　　细胞性免疫原：人、动物、微生物或寄生虫细胞。　　以红细胞抗原的制备为例：　　无菌采取抗凝血。　　XXr/min离心10min，吸弃上层保存液及血浆。　　用约8倍的%NaCl溶液洗涤3次。　　用无菌生理盐水悬起RBC，制成2%-5%的RBC悬液即可免疫动物。阿氏液细菌细胞抗原的制备　　以大肠杆菌为例：　　1.取大肠杆菌菌种接种于普通琼脂平板上，37℃培养10-20h。　　2.把菌体刮下，置于含无菌玻璃珠和生理盐水的三角瓶中，摇动混合菌体，60℃孵育1小时杀菌。　　3.5000r/min离心10min，弃上清，用生理盐水洗涤一次。　　4.无菌检验后，配成8×108/ml的菌悬液，加入石碳酸，终浓度为%，即为细菌悬液抗原。　　寄生虫细胞性抗原的制备　　寄生虫一般较细菌或病毒大，结构与成分复杂，其成分和分泌物一般具有较强的抗原性。　　多细胞寄生虫细胞性抗原的制备：　　1.虫卵的分离：2.冻干虫卵的制备：3.破碎虫卵抗原提取：将冻干虫卵充分研磨后，用生理盐水配成V/V=1:100的虫卵悬液，-70~-80℃反复冻融5次或4℃超声粉碎，再4℃10000~1XXr/min离心30min。上清液即为虫卵粗抗原。　　可溶性抗原的制备与纯化　　1.细胞抗原成分的提取　　酶处理法：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等。特点是作用条件温和，内含物成分不易受到破坏，细胞壁破坏程度可以控制等。　　冻融法：方法是-20℃冻完全冻结，然后37℃融化，反复2-3次。适用于组织细胞，对微生物细胞作用差。　　超声破碎法：使用频率1~20kHz，1-2min/次，总时间10-15min。　　表面活性剂处理法：SDS，吐温，Triton-100等。特点是比较温和，常用于提取核酸。　　2.蛋白质抗原的制备　　离心分离法：适用于少数大分子抗原的分离，如IgM，C1q等。　　盐析法：盐析法可用于粗提免疫球蛋白，去掉血清白蛋白等组分。也可用于浓缩免疫球蛋白。　　在蛋白质胶体溶液中加入中性盐可以使蛋白质分子从溶液中析出，这一过程称为盐析。中性盐离子大量进入蛋白质胶体溶液时，影响水分子与蛋白质分子极化部分的相互作用而减少其亲水性，并中和其电荷，最后使蛋白质分子聚集沉淀。　　各种蛋白质聚集沉淀所需要的中性盐浓度不同，控制盐的浓度，就能将血清中的免疫球蛋白分离出来。　　用于盐析的中性盐一般是硫酸铵。因为其溶解度高且受温度影响小，一般不引起蛋白质的变性。　　用%的饱和硫酸铵提取免疫球蛋白时，可获得较纯的IgG，但会损失一部分?-球蛋白。　　用50%的硫酸铵提取IgG时产量较高，但?-球蛋白也会同时沉淀。　　如要将血清中各种免疫球蛋白都分离出来，可用50%的饱和硫酸铵。　　凝胶过滤法　　凝胶过滤主要是利用具有分子筛效应的多孔网状凝胶作介质，按照各物质分子量的不同、分子形状和水化作用的不同，在层析柱上进行分离。　　一些小分子物质可以进入凝胶粒子内部，洗脱时速度较慢，大分子物质被阻于凝胶粒子外，洗脱较快。　　常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、交联聚丙酰胺和琼脂糖凝胶等。　　离子交换层析法　　离子交换层析是利用蛋白质带电部分与具有相反电荷的离子交换剂的吸附和解吸附原理进行的。　　常用的离子交换剂有DEAE纤维素和QAE-交联葡聚糖A-50，二者都是碱性阴离子交换剂，当溶液PH高于蛋白质等电点时，其阳离子基团可与蛋白质的阴离子基团交换吸附。当溶液PH接近蛋白质等电点时，蛋白质静电荷变为零，不能吸附，被洗脱下柱。　　由于各种蛋白质带电量不同，与离子交换剂结合能力也不同，用一定PH的溶液洗脱即可将它们分开。　　在碱性溶液中血清蛋白质的解吸附次序是：?球蛋白带电荷最少，首先洗脱；其次为　　?球蛋白和?球蛋白，最后为白蛋白。　　3.核酸抗原的制备　　一般认为大分子量的核酸具有免疫原性，但纯化的核酸往往很难诱导抗体的产生，但将变性的核酸偶联到载体如甲基化的BSA上，并同时注射佐剂，就很容易获得抗核酸的抗体。　　半抗原免疫原的制备　　1.常见的半抗原种类及性质　　种类：多糖、多