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实验九 伪狂犬病毒PCR诊断;实验目的：;什么是PCR？ ;PCR及有关技术的发展历史（1）;PCR及有关技术的发展历史（2）;PCR及有关技术的发展历史（3）;PCR及有关技术的发展历史（4）;PCR原理;PCR原理;（1）DNA模板的热变性
将待扩增DNA加热到940C左右，使双链DNA解开成为单链，并游离于反应体系中作为模板。
（2）模板与引物的结合（退火或复性）
将体系温度降至合适温度（520C左右），使加入的引物与模板DNA两端（3ˊ端）碱基序列互补结合。;（3）引物延伸
将体系温度升到720C左右，Taq聚合酶催化dNTP
按碱基互补原则连接在DNA引物3ˊ端，使链延伸，
形成两条与模板互补的新链。
以上为1次PCR循环（变性、复性和延伸）
（新合成的链可作为下一轮循环的模板）
按照上述（变性、复性和延伸）3个步骤反复循环 ，PCR产物呈指数扩增。
模板DNA 扩增倍数T=2n (n: ???环次数)。;PCR原理;PCR product;标准的PCR反应体系;;; 2. PCR各要素及其作用
（1） 模板
PCR模板可以是DNA或RNA。
以线性DNA模板为佳，量适中，一般为102?105个拷贝；
RNA作为模板时，需要：
RNA cDNAPCR, 称此为RT-PCR.
（2）耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)
是从耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可在95℃稳定30分钟。从而保证PCR在[94℃变性→ 52℃退火→72℃延伸]循环30次过程中不变性失活。 ;酶及其浓度;引物;引物设计的原则（一）;引物设计的原则（二）;引物设计的原则（三）;引物在线设计网址：;;;dNTP 的质量与浓度;Mg2+浓度;PCR反应条件的选择;温度与时间的设置：;① 变性温度与时间：; ② 退火(复性)温度与时间：;引物的复性温度 通过以下公式帮助选择合适的温度：;③ 延伸温度与时间：;循环次数;（6）参数
变性温度与时间
一般选择： 940C， 30秒
退火温度与时间
取决于引物长度、浓度 和G+C含量，
一般选择： Tm - 5℃
延伸温度与时间
一般选择： 70℃ ?75℃
循环次数
取决于模板浓度， 一般循环：30次;PCR反应特点;PCR产物分析
凝胶电泳分析法
可用琼脂糖（Agrose）或聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳检测PCR??增产物的大小。
同时应以标准DNA分子量作平行对照，凝胶中加入溴化乙锭，电泳后，紫外检测仪下观察结果并拍照。
（在待检靶序列拷贝数多、且仅扩增出一条带时，用此法即可满足检测要求。）;二 伪狂犬病毒PCR检测-试剂盒;;使用方法;注意事项：;作业
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