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赛业（广州）生物科技有限公司 显微注射用BAC DNA 的制备 用于显微注射的DNA 的纯度对于成功产生转基因小鼠是极其关键的。细菌内毒素或有机物污染都可能显 著降低DNA 的整合效率和/或显微注射后胚胎的存活率。目前有许多方法可以制备高纯度的BAC DNA ，为获 得高纯度的BAC DNA ，保证显微注射服务的成功率，我们推荐以下的制备方法。 由于BAC DNA 非常大且很容易被切断，所以在处理BAC DNA 时最重要的是尽可能地保持轻柔的操作， 包括慢慢地吸液，避免漩涡并避免冻存。当吸取BAC DNA 时，可剪掉移液枪头的尖端部分，这样在一定程度 上可减少吸液过程中对DNA 的剪切。BAC DNA 在线性化后的操作中要更加小心，因为线性化的BAC 比环状 的BAC 更容易被切断。 注意：传统操作中研究人员常将用于注射的BAC DNA 线性化。然而越来越多的实验室不再对BAC DNA 进行线性化，他们发现与对应的线性化BAC DNA 相比，环状的DNA 也可以在转基因胚胎中获得相同的LacZ 染色模式。我们的研究也发现确实这样，环状BAC DNA 更易于注射且可能产生更好的结果（更高频率的转基 因胚胎）。因此我们推荐您考虑注射环状BAC DNA ，这样也可以为您节省制备DNA 的时间。 推荐的BAC DNA 制备方法： 用以下任何一种试剂盒分离BAC DNA ：NucleoBond PC 100 Kit (Clontech: Cat# 740573); 或PowerPrep HP Maxiprep Kit with Prefilters (Marligen: Cat# 11476-025). 如果您希望注射环状BAC DNA ，那么在最后一步您需要用BAC 注射缓冲液洗脱DNA 。 如果您希望注射线性化的BAC ，那么按以下步骤进行： - 用限制性内切酶在约200 μl 的酶切体系中消化大约50 μg 的BAC DNA 。 - 消化后通过Sepharose 4B-CL 柱纯化DNA ，可以在一支经硅化处理的（并烤干的）2 ml 玻璃移液管中制 备纯化柱，玻璃移液管的末端敲掉一点点这样可以形成一个大一点的孔。为了构建纯化柱，您可以用硅化处理 的（并烤干的）玻璃丝来堵住移液管的底部；同时在移液管的顶部系上一个10 ml 的一次性使用注射器的针筒 作为缓冲液贮容器。Sepharose 4B-CL 的珠子首先要用BAC 注射缓冲液清洗并平衡，依靠重力排空纯化柱。纯 化柱一旦排空，缓慢地将消化混合物加入到纯化柱中，随后慢慢加入BAC 注射缓冲液进行洗脱。收集大约12 个0.3 ml 的洗脱液。您可以手动完成操作，这需要1-2 小时。洗脱下来的液体保存在4 ℃。 - 每一部分取5 μl 点样到CHEF 凝胶上，并以已知浓度及大小的标准品做对照。如果从消化液中能分离出 BAC 载体骨架和目的片段，我们发现含载体片段的洗脱液为3 或4 部分，而含插入片段的洗脱液为6 或7 部分 （部分的差异取决于插入片段的大小）。具有最高DNA 浓度的这部分就是我们需要用的，通常浓度应高于50 ng/μl 。 用分光光度计（例如NanoDrop ）测量DNA 浓度。于4 ℃保存。 客户需要向我们提供至少100 μl 溶解在BAC 注射缓冲液中的DNA ，且浓度不低于40ng/μl，同时需要附上 DNA 的凝胶电泳图片。DNA 的运输可以在室温下进行。 缓冲液配方： BAC 注射缓冲液含有： - 10 mM Tris - 0.1 mM EDTA - 100 mM NaCl TAQW03A0 显微注射用BAC DNA 的制备.doc 1/2 赛业（广州）生物科技有限公司 40 ml BAC 注射缓冲液