高通量测序技术的类型原理及应用--.pptVIP

目前，已经建立了至少三种依赖于高通量测序的DNA甲基化分析技术： 甲基化DNA免疫共沉淀测序( methylated DNA immunoprecipitation sequencing，MeDIP-Seq)； 甲基结合蛋白测序(methyl-binding protein sequencing，MBD-Seq ) ； 亚硫酸氢盐测序( bisulfite-sequencing，BS-Seq)。 MeDIP-Seq和MBD-Seq首先通过特异性结合甲基化DNA的MBD2b 或5‘-甲基胞嘧啶抗体富集高甲基化的DNA，然后再对富集到的片段测序； MeDIP-Seq 和MBD-Seq 都是基于富集的原理，二者是相辅相成的。MeDIP-Seq 对高度甲基化和高密度的CpG 更加敏感，而MDB-Seq 对高度甲基化和中等密度的CpG 更加敏感； BS-Seq不经过富集直接测序。 存在的问题 测序速度提高了，但后续的海量测序数据的分析却成为一大难题。 不适合小规模测序。 新一代测序仪价格昂贵。 Hiseq 2000高通量测序仪 solexa高通量测序仪 发展趋势 焦磷酸测序等测序平台都依赖生物化学反应。这不但加大了测序成本，而且浪费了时间，不利于测序速度的提升。因此，非光学显微镜成像、纳米孔和生物孔等直接测序技术是未来的发展方向。 相信随着高通量测序成本的进一步降低和对海量数据处理能力的不断提高，高通量测序将成为一项常规的实验手段，并为生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。 谢 谢！ * 复旦大学 复旦大学 复旦大学 高通量测序技术 主要内容 类型及原理 2 应 用 3 4 1 概 述 致 谢 概 述 高通量测序技术(High-throughput sequencing) 又称“下一代”测序技术”、深度测序 以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能。 类型及原理 目前，所说的高通量测序技术主要是指454 Life Sciences 公司、ABI 公司和Illumina公司推出的第二代测序技术以及Helicos Heliscope TM 和Pacific Biosciences 推出的单分子测序技术。 2005年，454 Life Sciences 公司( 现已被Roche公司收购) 首先推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统，开创了第二代测序技术的先河。 第二代测序技术 原理：酶级联化学发光反应 1.首先将PCR 扩增的单链DNA 与引物杂交，并与DNA 聚合酶、ATP 硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物荧光素酶和5-磷酸硫酸腺苷共同孵育。 第二代测序技术 2.在每一轮测序反应中只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸。 原理：酶级联化学发光反应 3.焦磷酸盐被硫酸化酶转化为ATP，ATP 就会促使氧合荧光素的合成并释放可见光，CCD 检测后通过软件转化为一个峰值，峰值与反应中掺入的核苷酸数目成正比。 第二代测序技术 此后，Illumina 公司和ABI 公司相继推出了Solexa和SOLiD(supported oligo ligation detetion)测序技术。 第二代测序技术 即生成新DNA 互补链时，要么加入的dNTP 通过酶促级联反应催化底物激发出荧光，要么直接加入被荧光标记的dNTP 或半简并引物，在合成或连接生成互补链时释放出荧光信号。 通过捕获光信号并转化为一个测序峰值，获得互补链序列信息。 原理：与焦磷酸测序法的类似，核心思想都是边合成边测序(sequencing by synthesis)。 第二代测序技术 第二代测序技术 优点： 操作极为简便：无需进行电泳； 可以在芯片上进行高通量分析； 大大节省了成本和时间。 Illumina公司目前拥有三种测序平台，分别为HiSeq 2000、HiSeq 1000、Genome Analyzer IIx (/ )； ABI 公司则主要是SOLiD 3 和SOLiD 4 两个测序平台。 从通量这个最直观的数字看来，HiSeq 2000领先于SOLiD 4。 HiSeq 2000 测序平台单次反应可以读取200G的数据，而SOLiD 4 仅为100G 左右。 第二代