荧光实时定量PCR.pptVIP

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * E=10 -1/斜率-1 * * * 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定， 对数期 Ct值则极具重现性 结论 在荧光信号的对数生长期 一定阈值下的循环数即Ct值与样品起始浓度成线性相关 不同样品间扩增效率的相对差异小 同一样品不同次的扩增效率的相对差异小 基因表达定量 4 2种定量目标 检测起始模板数的精确拷贝数 ?标准曲线法 病毒感染的定量监测 HIV RNA，HCV RNA 不同处理的样本之间基因的表达差异 2 -△ △ Ct 、Pfaffl等 ? 双标准曲线法 药物处理对目的基因表达的影响 病人和正常人目的基因的差异 绝对定量 相对定量 绝对定量的标准品 标准样品的种类： ?含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 ?含有和待测样品相同扩增片段的cDNA ?纯化的待测样品扩增PCR的产物 紫外分光光度计或荧光酶标测定标准样品的浓度， 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释。 绝对定量——标准曲线 LogX0与Ct呈线性关系， 通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线， 根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量 相对定量 Sample B Sample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 相对定量内参 稳定表达于不同类型的细胞和组织,而且其表达量是近似的,无显著性差别; 其稳定的表达水平与目标基因相似; 不受任何内源性或外源性因素的影响,如不受任何实验处理措施的影响 GAPDH，b-Actin，18S 相对定量 对目的基因和内参基因同时做PCR 待测样品目的基因的浓度 待测样品内参基因的浓度 . 对照样品目的基因的浓度 对照样品内参基因的浓度 目的基因处理前后变化= 双标准曲线法 对目的基因和内参基因做两组标准曲线 待测样品目的基因的浓度 待测样品内参基因的浓度 . 对照样品目的基因的浓度 对照样品内参基因的浓度 目的基因处理前后变化= 检测样品 内参基因H 目的基因X 定量结果 定量结果 校正值 相对量 对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000 待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037 待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874 相对定量的算法 2 -△ △ Ct – 假设 100% efficiency – 一个内参基因 Pfaffl法 – 扩增效率 – 一个内参基因 Vandesompele 法 – 扩增效率 – 多个内参基因均一化 2 -△ △ CT 假设目的和参照基因扩增效率都接近100％且相对偏差不超过5％  样品 目的基因(mean Ct) 内参基因(means Ct) △ Ct △ △Ct 2 -△ △ Ct 处理前 18 17 1 0 1 处理后 16 17.4 -1.4 -2.4 5.3 扩增效率 PFAFFL法 等位基因鉴定原理 5 双探针法 * * * * * * * * * * * * * * 荧光实时定量PCR 童攒tongzanbio@ 基本概念 化学光学原理 基因表达定量 4 1 2 3 等位基因鉴定原理 5 数学原理 基本概念 1 PCR 链式反应的雪崩效应 典型PCR的四个阶段 Base 实时荧光定量PCR PCR扩增反应中，引入一种荧光化学物质， 对每一个循环产物荧光信号的实时检测 可以得到荧光扩增曲线 实现对起始模板定量和定性分析 荧光物质 激发光 发射光 滤光片 检测（观察） 两种定量化学 染料染色 SYBR Green I 是一种DNA小沟结合染料 与DN